Tørrstoffet av det organiske materialet (biomassen) laget i fotosyntesen kommer ca. 89% fra CO2, 7% fra vann og 5% fra mineraler. De autotrofe organismene er primærprodusenter og danner første trinn i næringspyramider. CO2-assimilasjon i fotosyntesen, og utslipp av CO2 i cellerespirasjon og fotorespirasjon er de viktigste elementene i den globale karbonsyklus.
En forenklet oppsummering av fotosyntesen skrives som:
6CO2 + 12H2O → C6H12O6 + 6O2 + 6H2O
Her er glukose (C6H12O6) satt opp som eksempel på en av de mange tusen grunnleggende organiske bestanddeler som blir laget i de autotrofe organismene. De autotrofe plantene bygger seg selv, og gir energi og bestanddelene som trengs av de heterotrofe organismene (dyr, mennesker, sopp, bakterier). Først blir 12 molekyler med vann (H2O) oksidert med sollys som energi i fotosyntesens lysreaksjon, hvor det dannes seks tjuefire elektroner (e-) og protoner (H+), og seks molekyler oksygen (O2) blir et biprodukt. For å kunne frakte elektroner trengs mikronæringsstoffer (jern, kobber, mangan) og kinoner, og for å opprettholde enzymaktivitet og inkorporere andre uorganiske forbindelser trengs makronæring, som inngår i mineralnæringen i planter og tilføres plantene i form av gjødsel. Oksygen som biproduktet fra vann som elektronkilde ga en dramatisk endring i evolusjonen av livet på Jorden.
12 H2O → 24 e- + 24 H+ + 6 O2
Vann finnes det mye av på Jorden som gir rikelig tilførsel elektroner som er nødvendig for å kunne redusere CO2 i fotosyntesens karbonreaksjon. Elektronene blir fraktet i form av reduksjonskraften NADPH. Protonene inngår i protongradienter over tylakoidmembranene som kjemiosmotisk via fotofosfylering lager kjemisk energi i form av ATP. Fosforylerte forbindelser behøver tilgang på uorganisk fosfat fra gjødsel.
6 CO2 + 24 e- + 24H+ → C6H12O6 + 6 H2O
Syklusen i karbonassimilasjonen består av tre hovedtrinn: 1) Karboksylering (fiksering av CO2 eller hydrogenkarbonat HCO3-). 2) Reduksjon av CO2 med elektroner fra vann og 3) Regenerering av CO2-akseptoren.
Karboksyleringen skjer ved at fem-karbon akseptoren ribulose 1,5-bisfosfat (RuBP) bindes til CO2 og vann katalysert av enzymet ribulose 1,5-bisfosfatkarboksylase/oksygenase med akronymet rubisko. Oksygenaseaktiviteten til rubisko, hvor oksygen (O2) konkurrerer med CO2 om bindingssetet i rubisko gir opphav til fotorespirasjon.
Opptil 40% av det løselige proteinet i blader består av rubisko. Rubisko er satt sammen av 8 store subenheter (LSU) kodet av kloroplastgenomet og 8 små subenheter (SSU) kodet fra cellekjernen (L8S8). De små subenhetene starter translasjon av LSU mRNA. Total molekylvekt for rubisko er ca. 560 kDa i en konsentrasjon tilsvarende ca. 4 mM. Den lille subenheten er merket med en transit peptid i N-enden som anviser at den skal til gjennom kloroplastmembranen. Sammenkoblingen av subenhetene i rubisko til riktig konformasjon i stroma i kloroplastene er katalysert av chaperoner.
CO2 + H2O + ribulose-1,5-bisfosfat (RuBP) → 2 3-fosfoglycersyre (3-PGA)
Det dannes et ustabilt intermediat bestående av seks karbonatomer, 2-karboksy-3-ketoarabinitol-1,5-bisfoat), og ved hydrolyse av intermediatet dannes det to molekyler 3-fosfoglycersyre (3-PGA, 3-fosfoglycerat) som er de første stabile intermediatene i syklusen. Reduksjonen skjer ved at 3-fosfoglycerat fosforyleres til 1,3-bisfosfatglycerat ved hjelp av ATP fra lysreaksjonen katalysert av enzymet 3-fosfoglycerat kinase. Vi bruker endelsen -at når det er snakk om den ioniserte syren og -syre når den er protonisert:
3-fosfoglycersyre + ATP → 1,3-bisfosfoglycersyre + ADP
NADPH brukes deretter til å lage 3-fosfoglyceraldehyd katalysert av NADP-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase:
1,3-bisfosfoglycersyre + NADPH + H+ → 3-fosfoglyceraldehyd + NADP+
I dette trinnet skjer reduksjonen av CO2. Det samme enzymet brukt i oksidasjon i glykolysen bruker i stedet NAD som koenzym. 3-fosfoglyceraldehyd kan omdannes til dihydroksyacetonfosfat i en isomeringsreaksjon katalysert av triosefosfat isomerase.
3-fosfoglyceraldehyd ⇔ dihydroksyacetonfosfat (DHAP)
Glyceraldehyd-3-fosfat og dihydroksyacetonfosfat kalles triosefosfater. Triosefosfater eksporteres ut av kloroplasten i bytte med ortofosfat via en triosefosfat translokator. 5 molekyler triosefosfat ut av 6 nylagete trengs for å regenerere RuBP. For hver av de 6 molekyler triosefosfat trengs 5 for å regenerere tre molekyler ribulose 1,5-bisfosfat. Dihydroksyacetonfosfat og glyceraldehyd-3-fosfat gjennomgår en aldolkondensasjon katalysert av en aldolase og produktet er fruktose-1,6-bisfosfat:
3-fosfoglyceraldehyd + DHAP → fruktose-1,6-bisfosfat
Fruktose-1,6-bisfosfat hydrolyseres til fruktose-6-fosfat katalysert av fruktosebisfosfat fosfatase:
fruktose-1,6-bisfoat + H2O → fruktose-6-fosfat + Pi
En enhet på to karbonatomer overføres fra fruktose-6-fosfat til et tredje molekyl 3-fosfoglyceraldehyd og gir erythrose-4-fosfat og xylulose-5-fosfat katalysert av en transketolase:
fruktose-6-fosfat + 3-fosfoglyceraldehyd → xylulose-5-fosfat + erythrose-4-fosfat
Erythrose-4-fosfat kombineres med et fjerde molekyl 3-fosfoglyceraldehyd og gir sjukarbonsukkeret sedoheptulose-7-fosfat katalysert av en aldolase:
erythrose-4-fosfat + DHAP → sedoheptulose-1,7-bisfosfat
Seduheptolose-1,7-bisfosfat hydrolyseres til seduheptolose-7-fosfat katalysert av seduheptolose-1,7-bisfosfat fosfatase:
sedoheptulose-1,7-bisfoat + H2O → sedoheptulose-7-fosfat + Pi
Seduheptolose avgir to karbonatomer til et femte og siste molekyl glyceraldehyd-3-fosfat, katalysert av en transketolase og produktene er xylulose-5-fosfat og ribose-5-fosfat:
sedoheptulose-7-fosfat + 3-fosfoglyceraldehyd → ribose-5-fosfat + xylulose-5-fosfat
De to molekylene med xylulose-5-fosfat omdannes til to molekyler ribulose-5-fosfat katalysert av en epimerase og ribose-5-fosfat omdannes til ribulose-5-fosfat katalysert av en isomerase. Ribulose-5-fosfat kinase fosforylerer de 3 molekylene med ribulose-5-fosfat til 3 molekyler med CO2-akseptoren ribulose-1,5-bisfofat:
ribose-5-fosfat → ribulose-5-fosfat
xylulose-5-fosfat → ribulose-5-fosfat
3 ribulose-5-fosfat + 3ATP → 3 ribulose-1,5-bisfosfat + 3 ADP
I sammendrag deltar de følgende enzymer i de 13 reaksjonene:
1. Ribulose-bisfosfat karboksylase
2. Fosfoglycerat kinase
3. NADP-glyceraldehydfosfat dehydrogenase
4. triosefosfat isomerase
5. Aldolase
6. Fruktose bisfosfatase
7. Transketolase
8. Aldolase
9. Sedoheptulose-1,7-bisfosfatase
10. Transketolase
11. Ribose-5-fosfat isomerase
12. Ribulose-5-fosfat epimerase
13. Fosforibulokinase.
Reduktiv pentosefosfatvei lager sine egne substrater. Hastigheten på syklusen øker til en maksimal fluks. 1/6 av karbonet er tilgjengelig for eksport til sukrose eller stivelse. 5/6 for regenerering av RuBP.
For å lage en heksose fra 6 molekyler med CO2 trengs 18 ATP og 12 NADPH, dvs. det forbrukes 3 molekyler ATP og 2 molekyler NADPH for hvert CO2 molekyl som blir fiksert.
Vann inngår i reaksjonene katalysert av rubisko og fosfataser (seduheptulosebisfosfat fosfatase og fruktose bisfosfat fosfatase. Når ATP hydrolyseres til ADP og uorganisk fosfat forbrukes det vann.
Calvinsyklus er en energieffektiv prosess. Heksose som blir fullstendig oksidert ved respirasjon frigir 2804 kJ mol-1. Hydrolyse av ATP frigir 29 kJ mol-1 og NADPH som blir oksidert frigir 217 kJ mol-1. Totalt gir dette en effektivitet på ca. 90% (12A217 + 18A29 = 3126 kJ mol-1).
I fullt sollys kan reduktiv pentosefosfatvei begrense fotosyntesen. Feedbackregulering (tilbakekoblingsregulering) av stroma- og tylakoidreaksjoner via tilgjengeligheten av NADPH. Mengden NADP/NADPH i kloroplasten er ca. 20 nmol mg klorofyll-1, hvorav ca. 50 % er i redusert form i lys. NADP+ kan lages fra NAD+ i stroma. Mengden adenylater (ATP, ADP, AMP) er ca. 60 nmol per mg klorofyll.
Proteinkonsentrasjonen av rubisko 300 mg ml-1 CO2 konsentrasjonen i kloroplasten ved 25 oC er ca. 10 mikromolar (μM) ved steady state fotosyntese mens Km for CO2 i luft er ca. 20 μM. Maksimal karboksylering blir da 1 mg CO2 /h mg karboksylase. Netto fotosyntese for C3 plante er ca. 25 mg CO2 dm-2 h, dvs. det trengs 25 mg RuBP på dette arealet. Den høye Km-verdien for rubisko vil si at med dagens CO2-konsentrasjon går rubisko med halv hastighet. Tilførsel av karbondioksid til C3-planter vil derved gi midlertidig økt vekst hvis næringstilgangen er god. Dette er et fenomen som kalles CO2-gjødsling og er benyttet i veksthusnæringen. Den spesifikke aktiviteten er også lav 1-4 μmol min-1 mg protein-1. Opptil 50 % av bladproteinet kan være rubisko.
Skyggeblad har lavere lysmettet fotosyntese og mindre mengde rubisko enn solblad. Rubisko er fritt løselig i stroma men er bundet med elektrostatiske krefter til tylakoid og kloroplastmembranen. I blågrønnbakterier mangler rubisko i de nitrogenfikserende heterocystene. Dette fordi nitrogenase ikke tåler oksygen. I fotosyntetiserende vegetative celler er rubisko fordelt mellom løselig i cytoplasma og partikulært i karboksysomer.
CO2 (+4) er en av de mest oksiderte formene av karbon. I 3-fosfoglycerat har karbon oksidasjonstrinn (+3) og i glyceraldehyd-3-fosfat (+1).
CO2 assimilasjon i anaerobe fotosyntetiske bakterier
Anaerobe fotosyntetiske bakterier bruker ikke Calvin-syklus. Grønne svovelbakterier bruker reduktiv sitronsyresyklus (reduktiv Krebssyklus eller reversering av trikarboksylsyresyklus) til å lage organiske syrer som oksalacetat, hvor acetyl-CoA brukes som CO2 akseptor. Redusert ferredoksin brukes som elektronkilde og produktet er pyruvat. CO2 kan deretter bindes i overgangen fosfoenolpyruvat til oksalacetat, mellom succinyl-CoA og 2-oksoglutarat og mellom 2-oksoglutarat og oksalosuccinat. Metanogene bakterier og acetogene bakterier bruker acetyl-CoA biosynteseveien. Grønne ikke-svovelbakterier kan bruke en glyoksylatproduserende syklus ( hydroksypropionsyre biosynteseveien) til fiksering av karbondioksid.
Regulering av Calvin-syklus
Enzymkonsentrasjon er regulert via genekspresjon og proteinsyntese. Reduktiv pentosefosfatvei reguleres av lys. Det skjer ingen CO2 assimilasjon i mørke i reduktiv pentosefosfatvei og følgende 5 enzymer i Calvinsyklus reguleres av lys: rubisko, NADPH-glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase, fruktose-1,6-bisfosfat fosfatase, seduheptolose-1,7-bisfosfat fosfatase, rubisko aktivase, ATP syntase og ribulose-5-fosfat kinase. Lyskontrollen skjer ved reduksjon-oksidasjon av disulfid via ferredoksin-thioredoksin. Thioredoksin overfører signalet om redokspotensialet i kloroplasten.
Aktiveringen skjer ved at elektroner fraktes fra redusert ferredoksin til svovelproteinet tioredoksin katalysert av ferredoksin-thioredoksin reduktase. Ferredoksin inneholder to jernatomer og to svovelatomer per molekyl. Ferredoksin kan overføre elektroner til NADP+, glutamat syntetase, nitritt reduktase, thioredoksin og sulfitt reduktase. Redusert thioredoksin reduserer disulfidbindinger og gir frie SH-grupper i proteiner. -S-S- gir inaktivt enzym og -SH SH- gir aktivt enzym.
Thioredoksin er proteiner med aktive disulfidgrupper, og ferredoksin eller NADPH brukes til å lage thioredoksin i redusert form som igjen kan redusere disulfidbindinger i andre proteiner. Hos C4-planter aktiveres NADP-malat dehydrogenase av thioredoksin.
Rubisko aktiveres også av Mg2+ og CO2 hvor CO2 reagerer med ε-NH2 på et lysin i det aktive sete i en karbamyleringsreaksjon. Deretter bindes Mg2+. Rubisko aktivase er et enzym som fjerner ribulose-1,5-bisfosfat fra en dekarbamylert inaktiv form av rubisko ved hjelp av ATP, og gir konformasjonsendring til aktiv form av rubisko. Aktivase inneholder ATPase og chaperonase. De to typer protein i aktivase er dannet ved alternativ spleising av pre-mRNA.
2- karboksyarabinitol-1-fosfat ligner et ustabilt C6-intermediat og er en inhibitor som bindes til rubisko slik at enzymet ikke kan aktiveres av aktivase. Det er mest karboksyarabinitol om natten.
Lys gir gir mer basisk stroma, økning fra pH 7 til 8 i lys, og økning i konsentrasjonen av magnesium (Mg2+). Høyere pH passer bedre med pH optimum for enzymene i Calvin syklus.
Triosefosfat byttes mot fosfat via fosfattranslokatoren i kloroplastmembranen. Tilgangen på fosfat kan derved også være med å regulere Calvin-syklus.
Fosfat- og dikarboksylattranslokator
Fosfat fraktes inn i stroma fra cytosol i antiport bytte med dihydroksyacetonfosfat (triosefosfat). Dihydroksyacetonfosfat omdannes til 3-fosfoglycersyre via 3-fosfoglyceraldehyd som gir NADH og 1,3-difosfoglycersyre som igjen gir ATP og 3-fosfoglycersyre. På denne måten kommer ATP og NADH ut i cytplasma. 3-fosfoglycersyre fraktes inn i kloroplasten i bytte mot fosfat som igjen reduseres til dihydroksyacetonfosfat i kloroplasten. For kloroplaster i frukt er ikke fotosyntesen hovedfunksjonen, men biosyntese. I disse kloroplastene er det en heksosefosfat translokator som frakter glukose-6-fosfat.
Dikarboksylattranslokator frakter dikarboksylsyrer som oksaleddiksyre, malat, aspartat og 2-oksoglutarat over kloroplastmembranen. Kan brukes til å frakte reduserende ekvivalenter over membranen.
Reduktiv pentosefosfatvei skjer i stroma i kloroplastene. Reduksjonskraften NADPH og ATP kommer fra fotosyntesens lysreaksjon. Calvin og medarbeidere tok i bruk den radioaktive karbonisotopen 14C og kunne ved bruk av alger, todimensjonal papirkromatografering og autoradiografi identifisere at det er ribulose-1,5-bisfosfat som er akseptoren for CO2 i fotosyntesen, katalysert av enzymet rubisko, et enzym som virker både som karboksylase og oksygenase.
Kjemiske strukturformler for metabolitter i Calvin-syklus.
Både oksidativ og reduktiv pentosefosfat gir en rekke intermediater som inngår i andre biosynteseveier.