I et dobbeltstråle-spektrofotometer vil lysstrålen passere både prøven og en referanse slik at man kan få et direkte mål på forskjellen i absorbanse mellom de to løsningene. I dobbeltstrålespektrofofotometer i rom blir den opprinnelige lysstrålen splittet i to stråler som passerer gjennom to identiske optiske systemer på samme tid. En stråle passerer gjennom prøven og den andre gjennom referansen. I dobbeltstrålespektrofotometere i tid vil den vil den opprinnelige strålen enten passere prøven eller referansen. Dette får man til med en chopper som er en sirkelrund plate med alterende hull og reflekterende flater.
Lyset som kommerer gjennom kuvetten (laget av plast, glass, eller kvarts) i prøven blir registrert av en detektor (fotomultiplikator) Et enkeltstrålespektrofotometer kalles et fotometer.