Show summary
Inntak av rusmidler endrer signaliseringssystemet av nevrotransmittere i hjernen. For å kunne vurdere effekten av forskjellige rusmidler er det derfor viktig å kunne bestemme nivåene av nevrotransmittere. Dette kan studeres ved rusmiddeleksponering av forsøksdyr, med påfølgende analyse av hjernevev eller hjernens ekstracellulære væske (ECV) ved anvendelse av avanserte analytiske teknikker. Ved avdeling for rusmiddelforskning og metodeutvikling ved divisjon for rettsmedisinske fag på Folkehelseinstituttet (FHI) drives forskning på nevro¬biologiske mekanismer for akutt og gjentatt rusmiddel¬eksponering. I denne forbindelse benyttes dyremodeller med rusmiddel-eksponering av rotter og mus. Mange rusmidler virker inn på det serotonerge systemet i hjernen og målet med denne oppgaven var primært å utvikle og validere en ultraytelse væske¬kromatografi tandem massespektrometri (UPLC®-MS/MS) metode for bestemmelse av nevrotransmitteren serotonin (5-HT) og 5-HT-metabolitten 5-hydroksyindoleddiksyre (5-HIAA) i mikrodialysat fra rotte, men det var også ønsket å inkludere noradrenalin (NE), acetylkolin (ACh), glutaminsyre (Glu) og γ-aminosmørsyre (GABA). Underveis i metode-utviklingen ble dopamin (DA) og DA-metabolittene 3-metoksytyramin (3-MT), 3,4-di-hydroksy¬fenyl¬eddiksyre (DOPAC) og homovanilinsyre (HVA) inkludert i analysemetoden for å kunne få et mest mulig helhetlig bilde av endringer i nevrotransmitter¬nivåer ved rusmiddel-eksponering. Det ble også utviklet en metode for bestemmelse av nevro¬transmitterne og nevrotransmitter¬metabolittene i hjernevev. En UPLC-MS/MS metode for bestemmelse av 5-HT, 5-HIAA, DA, 3-MT, NA, ACh, Glu og GABA i mikrodialysat ble utviklet og validert. De negative ionene DOPAC og HVA måtte fjernes fra metoden fordi instrumentet som ble brukt til validering ga svært lavt/ikke signal i negativ modus. Ulike separasjons¬prinsipper og kolonner ble undersøkt før det ble funnet at gradient-eluering på en Waters Acquity UPLC HSS T3 C18-kolonne med en mobilfase bestående av 25 mM maursyre (FA) og metanol (MeOH) ga best separasjon og var best tilpasset laboratoriets rutine¬drift. Validering av metoden viste god linearitet (R2 > 0,99) over et stort konsentra-sjonsområde for alle forbindelser med unntak av NE. Minste detekterbare konsentrasjon (MDK) var 0,5-3,8 nM (5-HT, 5-HIAA, DA, 3-MT og ACh) og 14-55 nM (GABA, Glu og NE). Minste kvantifiserbare konsentrasjon (MKK) var 0,77-2,0 nM (5-HT, DA, 3-MT, ACh) og 12-3,6*102 nM (5-HIAA, GABA, Glu og NE). Repeterbarhet, intermediær presisjon og nøyaktighet var tilfredsstillende for alle analytter, med unntak av GABA, med relativt standardavvik (RSD) og bias på hhv. < 20 % og 80-120 % ved MKK og høyere konsentrasjoner. GABA viste avvikende repterbarhet (RSD =21 %) ved MKK. Det ble funnet at forbindelsene med lavest retensjonsfaktor; Glu, NE og ACh ble påvirket av matrikseffekter fra salter i prøvene. Intern standard (IS) for 3-MT var ikke optimal fordi matrikseffekter ble større etter korrigering. Det er ønskelig å anskaffe isotopmerkede IS for alle forbindelser for å korrigere for matrikseffektene. Det ble funnet at forbindelsene er mest stabile i askorbin¬syre, og bør tilsettes dette. Nevrotransmitterne og nevrotransmitter¬metabolittene er ustabile ved romtemperatur, i kjøleskap ved 4 °C og i fryser ved -20 °C. Det ble imidlertid funnet at forbindelsene var mer stabile i kjøleskap enn i fryser, men stabiliteten ved lavere temperaturer bør undersøkes. Nevrotransmittere i mikrodialysat fra en rotte eksponert for heroinmetabolitten 6-MAM ble bestemt med metoden. Det ble funnet at metoden kan brukes til å bestemme 5-HIAA, 5-HT, GABA og Glu i mikrodialysat fra det ventral tegmentale område (VTA) og nucleus accumbens (NAc) i rottehjerne. DA og 3-MT kunne detekteres i VTA og NAc, men oppkonsentrering kreves for kvantifisering. NE kunne detekteres, men grunnet den avvikende lineariteten og påvirkning fra matrikseffekter kunne ikke forbindelsen kvantifiseres nøyaktig. ACh finnes i for lave konsentrasjoner i VTA og NAc til å kunne kvantifiseres med metoden. Ved analyse av reelle prøver ble det vist en interessant økning av 5-HT og 5-HIAA etter eksponering for 6-MAM. En økning av 5-HT og 5-HIAA etter heroineksponering er kun blitt rapportert tidligere i,oss bekjent, én publikasjon. Endringen i 5-HT og 5-HIAA som følge av eksponering for heroinmetabolitten 6-MAM har ikke blitt vist tidligere og det er av interesse å undersøke dette inngående ved mikrodialyse av flere rotter. En UPLC-MS/MS-metode for bestemmelse av 5-HT, 5-HIAA, DA, 3-MT, DOPAC, HVA, NE, ACh, Glu og GABA i hjernevev ble utviklet og delvis validert. Separasjon av analyttene ble utført med gradienteluering på en Waters Acquity UPLC® HSS T3 C18 kolonne med en mobilfase bestående av 25 mM FA og MeOH. HVA og DOPAC oppfylte ikke fastsatte valideringskrav og revalidering skal utføres for disse. Validering av metoden viste god linearitet (R2 > 0,99) over et stort konsentrasjonsområde for alle forbindelser. MDK var 0,75-7,1 nM (5-HT, 5-HIAA, DA, 3-MT, NE, ACh, Glu og GABA) og MKK var 6,0-49 nM (5-HT, 5-HIAA, DA, 3-MT, NE, ACh, Glu og GABA). Repeterbarhet, intermediær presisjon og nøyaktighet var tilfredsstillende med RSD < 20 % og bias på 80-120 % ved MKK og høyere konsentrasjoner for alle forbindelser. Valideringen ble utført på to ulike instrumenter med forskjellig følsomhet og dette kan ha bidratt til økt variasjon. Det ble også funnet at det hadde vært en lekkasje i det ene instrumentet under valideringen, noe som kan ha ført til økt variasjon. Valideringen bør derfor utføres på nytt på instrumenter med lignende følsomhet for å undersøke om MDK og MKK kan bedres. Ulike prøveopparbeidingsmetoder for analyse av hjernehomogenat ble undersøkt. Proteinfelling med 85/15 acetonitril (ACN)/MeOH, 5 % perklorsyre (PCA) og 0,25 M FA ble utprøvd og det ble funnet at proteinfelling med 0,25 M FA ga høyest gjenfinning av analytt. Hjernevevsprøver fra dorsale striatum (DS), prefrontale cortex (PFC) og NAc fra mus eksponert for heroin og NaCl (kontrollgruppe) ble analysert med UPLC-MS/MS-metoden. Det ble funnet at metoden kan brukes til å kvantifisere alle nevrotransmitterne og metabolittene i hjernevev med unntak av HVA og DOPAC. For nøyaktig kvantifisering av prøver fra NAc kreves imidlertid ny validering siden NAc ble mer oppkonsentrert enn prøvene brukt ved validering. GABA og Glu finnes i for høye konsentrasjoner i homogenatprøvene til å kunne kvantifiseres direkte og prøver må fortynnes. Optimal fortynningsfaktor for kvantifisering av GABA og Glu bør finnes og en validering for bestemmelse av GABA og Glu utføres. Interessante tendenser til påvirkning av 3-MT nivå og nevrotransmitter/metabolitt-forholdstall etter rusmiddeleksponering ble vist og vil bli undersøkt inngående i videre studier ved FHI.
