- Restriksjonsenzymer og ligaser
- Plasmider, fager og kloning
- Hvordan lage en genmodifisert plante
- Hvorfor brukes antibiotikaresistensgener ?
- Transformering med Agrobacterium tumefasciens
- Ugrasmiddeltoleranse
- Sykdomsresistens
- Økt holdbarhet av grønnsaker og blomster
- Økt ernæringsverdi
- Økt stresstoleranse
- Spesielle farger
- Spesielle planteprodukter - økt eller redusert mengde
- Kryssingssystemer - hannsterilitet og apomiksisteknologi
- Genmodifiserte mikroorganismer
- Ubesvarte spørsmål og etikk
Hvordan lage en genmodifisert plante
Inneldning
Tradisjonell planteforedling med kryssing og kunstig utvalg med formål å fremskaffe rene linjer av kulturplanter er en svært tid- og arbeidskrevende prosess. Kulturplantene er ofte polyploide og dette skaper ekstra vanskeligheter i kryssingsarbeidet. Ved tradisjonell foredling er det mange gener involvert. Ønsker man f.eks. å overføre resistensgener ved å krysse med ville slektninger, kan en ulempe være at man får økt stengellengde i tillegg. Derfor må det etterpå drives tilbakekryssing, fordi man bare ønsker å få overført resistensgenene. Plantene må deretter selvpollineres gjennom flere generasjoner for at de skal bli genetisk like (rene homozygote linjer). Til slutt krysses de ofte med en annen homozygot linje for å frembringe en F1-hybrid som gir heterose (hybridstyrke). Genmodifisering ved molekylærbiologiske teknikker gjør at vi kan flytte gener mellom arter i alle organisme riker: planter, sopp, bakterier, dyr; og i tillegg fra virus og bakteriofager. Mange har sett på genteknologien som en mulighet til raskere å fremskaffe planter med ønskede egenskaper. De teknikkene som har blitt brukt til å nedregulere genuttrykk har vært antisensteknikk og kosuppresjon (genslukking). Ved antisensteknikk lager man en kopi av målgenet i antisensretning. Budbringer-RNA (mRNA) fra sens vil binde seg til mRNA fra antisens og derved hindre genuttrykket.
Ved koppsupresjonsteknikk setter mann inn et gen som lager det samme proteinet som genet man ønsker å undertrykke. Man skulle i dette tilfellet forvente enda større biosyntese av det aktuelle protein, men resultatet blir merkelig nok en nedregulering. Det har blitt spekulert over om planten registrerer at det kommer inn en fremmed gen og nedregulerer all aktivitet tilknyttet dette “fremmedelementet”. Kosuppresjon kan skyldes metylering av cytosin eller posttranskripsjons genslukking. Antibiotikaresistens har blitt brukt som seleksjonsmarkør for å kunne identifisere og plukke ut de plantene som har fått innsatt et fremmed gen og derved blitt genmodifisert.
Mulighetene som ligger i de molekylærbiologiske teknikkene og uoversiktelig konsekvensanalyse av de langsiktige virkningene av genmodifiseringen har skapt et opinionspress mot bruk av genmodifiserte planter. Økologer har vært bekymret for utilsiktede langtidsvirkninger på økosystemene. I laboratoriene har genmodifiserte planter imidlertid gitt biologene ny kunnskap og forståelse av sammenhengen mellom gener, fysiologi og fenotyputtrykk. Selv om økt matproduksjon er nødvendig, holder sannsynligvis ikke argumentet om at vi trenger genmodiserte planter for å hindre sult og til å mette stadig flere mennesker. Sistnevnte skyldes nok mer et fordelingsproblem.
Hvordan lage en genmodifisert plante ?
En genmodifisert plante har fått satt inn ett eller flere nye gener som gir planten andre egenskaper eller kvaliteter. Et gen koder for et protein. For å kunne lage transgene planter som overfører det innsatte genet til avkommet, må transgenet komme inn i vev som lager gameter. Dette kan gjøres ved å:
- 1) Overføre ett eller flere gener direkte til plantemeristemet.
- 2) Overføre ett eller flere gener til planteceller i kultur for deretter å regenerere planter.
Et gen man ønsker å sette inn i en plante isoleres fra en annen plante eller organisme. Det fremmede genet settes inn i en vektor (gentransportør/kloningsvektor). Foran transgenet må det være en promoter som starter transkripsjonen, og etter genet må det være en terminator som stopper transkripsjonen. I årene som kommer vil det bli arbeidet med vevsspesifikke promoterer. Det vil si at promoteren gjør at genet bare blir uttrykt i den typen vev man ønsker. For kornslagene vil det si gener som bare blir uttrykt i endospermen og/eller embryo.
Det fremmede genet overføres til planten med forskjellige teknikker f.eks. elektroporering, DNA mikroinjeksjon, partikkelbombardering (biolistisk transformasjon) eller med bruk av Ti-plasmid fra bakterien Agrobacterium tumefasciens.
Krongalle på Pelargonium forårsaket av Agrobacterium tumefasciens.
Binær Agrobacterium transformasjon er basert på at det dannes adventivskudd fra cellekulturer. Denne metoden har vært vanskelig å få til å virke på enfrøbladete planter, men med perfeksjonering fungerer den bl.a. på ris og mais. Neste trinn er å selektere ut de transgene cellene og få disse til å dele seg, vokse og bli til en transgen plante. For å kunne klare dette har man et markørgen som lager et enzym som gir plantecellene toleranse mot et toksisk stoff f.eks. et antibiotika eller ugrasmiddel. Slike markørgener er f.eks. nptII (neomycin fosfotransferase) eller bar (fosfinotricin acetyltransferase). I tillegg finnes det flere kloningsseter for restriksjonsendonukleaser som forenkler kloningen inn i vektoren.
35S fra blomkålmosaikkvirus (Cauliflower Mosaic Virus, CaMV) er en mye brukt promoter som uttrykker mange gener med høyt utbytte. Blomkålmosaikkvirus har et genom med dobbelttrådet DNA og i blomkålsmosaikkvirus har 35S bl.a. til oppgave å omdanne virus DNA til mRNA. Promoteren lager i seg selv ikke noe produkt, den virker bare som en på-bryter. 35S er imidlertid mindre effektiv i enfrøbladete planter. Man har hos enfrøbladete forsøkt bl.a. med å sette intron 1 fra mais alkohol dehydrogenase (adh1) bak promoteren. Bak transgenet setter man inn et termineringsgen som sikrer at transkripsjonen av det nyinnsatte genet stopper f.eks. 35S terminator eller NOS terminator (nopalin syntase).
Transgenet blir satt tilfeldig inn på flere steder i kjernegenomet og ofte flere ganger. Bombardering med mikroparikler kan gi DNA fragmenter som inkorporeres på andre steder i genomet. Cellene som inneholder transgener isoleres avhengig av responsen på utvalgte antibiotika, og deretter må plantene regenereres. Det nyinnsatte genet må identifiseres og stabiliteten av den nye genkonstruksjonen må undersøkes. Man må sjekke at det ikke har blitt dannet nye ukjente åpne leserammer som kan omsettes til mRNA. Deretter må det drives et omfattende kryssingsarbeid med tilbakekryssing for å få homozygote linjer, etterfulgt av feltforsøk og oppformering av frømateriale.
I det følgende gjennomgås det som til nå har vært sett på som innsatsområder for genmodifiseringen.
Nye teknikker for genredigering som CRISPR-CAS9.