PCR (eng. polymerase chain reaction) - En metode for oppformering (amplifisering) av små mengder DNA. Metoden kan brukes til å lage millioner med identiske kopier av et stykke med DNA. Metoden fra 1985 er opprinnelig basert på det varmestabile enzymet Taq DNA polymerase isolert fra den termofile (varmeelskende) bakterien Thermus aquaticus. Dobbelttrådet DNA som skal oppformeres varmes opp til ca. 94-98oC sammen med de fire deoksynukleotidene dATP, dCTP, dGTP og dTTP (også kalt med samlenavnet dNTP), DNA-primere, DNA polymerase og magnesium (Mg2+). Alle løsningene er pippetert med automatpipette opp i PCR-rør av plastikk. DNA denatureres ved den høye temperaturen slik at enkelttrådene skiller lag. Temperaturen senkes deretter til ca. 40 - 65 oC slik at enkelttrådene kan reagere og feste seg til korte DNA stykker på ca. 20 baser (primere) som er komplementære til sekvensen på den tråden som skal oppformeres. Lengden er primerne gjør dem spesifikke slik at omtrent bare DNA som inneholder disse primersekvensene oppformes.
Temperaturen heves til 72 oC og Taq polymerase deretter replikerer DNA fra 3´-OH-enden av primere, og derved har man fått to nye like DNA tråder fra den ene man startet fra. DNA polymerase lager DNA bare i 5´ til 3´retning. Prosessen gjentas og gjentas med fordobling av DNA for hver syklus inntil man har fått oppformert nok DNA til det formålet det skal brukes. Hvor mange sykluser man bruker i oppformeringen varierer med mengde nukleinsyre som skal oppformeres, vanligvis 20-30 sykluser,
Til å styre temperaturprogrmmet brukes en PCR termosykler (PCR-maskin), ofte basert på bruk av Peltier-elementer. Termosykleren har en varmeblokk som kan programmeres til det temperaturprogram, inkubasjonstid og antall sykluser man ønsker å bruke. Et alternativ er 3 vannbad, en stoppeklokke og manuell overføring. DNA stykkene som oppformeres får fra 3. syklus akkurat samme lengde avgrenset i begge ender av området som er komplementære til primerne. Alle de nye DNA som lages virker som templat (oppskrift) for nye DNA, slik at økningen vil bli eksponensiell. Antall DNA-stykker dobbles i hver syklus (2 n, hvor n er antall sykluser). Den høye temperaturen som er nødvendig for å atskille de to DNA-trådene ville også ha denaturert en vanlig DNA polymerase, dvs. man måtte ha tilsatt ny DNA polymerase etter hver syklus. Derfor kreves det et varmestabilt enzym, et enzym som beholder den katalyttiske aktiviteten selv om temperaturen er opptil 98 oC. Det er bare små mengder DNA som trengs som utgangsmateriale, i størrelsesorden nanogram som blir oppformert til mikrogrammengder, og man trenger heller ikke på forhånd å vite den ukjente sekvensen i DNA. Imidlertid må man kjenne til sekvensene på hver side av det DNA som skal oppformeres for å kunne lage primere som er komplementære til disse flankesekvensene. Lengden på primerne som brukes i par er vanligvis 15-20 basepar. Problemet med ukjente sekvenser på flankene forsvinner hvis man bruker fremmed DNA innsatt i en vektor. PCR kan også brukes til å identifisere organismer eller personer ut fra svært lite biologisk materiale. Den kraftige formeringsprosessen gjør at metoden er følsom for forurensninger med annen type DNA enn den som skal oppformeres, og stiller de største krav til renslighet.
PCR er blitt kalt biologenes "kjernereaksjon" og er en revolusjonerende teknikk for utvikling av molekylærbiologien. Den brukes i biologiske laboratorier verden over. Bruksområdene er mange: Identifisering av planter, dyr, mikroorganismer og virus; undersøkelse av genetiske sykdommer og kreft; DNA-fingerprinting i oppklaring av forbrytelser; studier av DNA i fossilt materiale; laging av nukleinsyreprober; og generell bruk i kloningsstudier. Produktene fra PCR kan atskilles ved kromatografering på agarosegel tilsatt ethidiumbromid slik at DNA kan observeres under UV-stråling. Arbeidet må utføres forsiktig siden ethidiumbromid virker mutagent og representerer helsefare. DNA-bånd med produktene kan kuttes ut og ekstraheres fra gelen. Enkelttrådet DNA kan brukes til sekvensering (bestemmelse av rekkefølgen av baser) etter Sangers dideoksymetode Alle kjemikalier som trengs for å utføre PCR kan kjøpes ferdig i "kits". DNA polymerase trenger magnesium (Mg2+) og konsentrasjonen av magnesium er en av de mange faktorene som kan påvirke resultatet i PCR. Gelatin eller bovint serum albumin kan tilsettes reaksjonsblandingen for å stabilisere DNA polymerase.Taq polymerase kan sette inn feil baser på enkelte steder. Varmestabil DNA polymerase er også blitt isolert fra Thermus litoralis og Thermus brockianus. Det er utviklet en rekke former for PCR-teknikker som revers transkriptase PCR (RT-PCR), invers PCR og sanntids-PCR.
Det skjer en enorm teknologisk utvikling av automatiserte høykapasitets sekvenseringsmaskiner brukt i sekvensering av genomer.
Sanntids-PCR
Sanntids polymerase kjedereaksjon (kvantitativ PCR, qPCR) blir brukt som diagnostisk verktøy (nukleinsyrediagnostikk) for å identifisere og genotype virus eller bakterier som gir sykdom, til å identifisere genmodifiserte organismer, identifisere muterte alleler eller som rent forskningsverktøy. Teknikken gjør det mulig å bestemme forekomst og mengde av en spesiell DNA-sekvens spesifikk for viruset eller bakterien. I sanntids-PCR følger man under den selve termosykliske PCR-reaksjonen mangfoldiggjøringen eller oppformeringen (amplifiseringen) av den utvalgte DNA-sekvensen som er spesifikk for virustype eller bakterieart, og ikke i ettertid når reaksjonen er avsluttet som ved en standard PCR. For å kunne registrere PCR-produktene under reaksjonen bruker man DNA-prober med en kjent og kort spesifikk sekvens av nukleotider, fluorescensmerkete oligonukleotider. Det er forskjellige teknikker for å identifiser produktene i PCR-reaksjonen ved bruk av spesifikke eller ikke-spesifikke fluorokromer. Når et fluorokrom belyses med laserlys med en bølgelengde som eksiterer fluorokomet, så vil det sende ut fluorescens (emisjon) med en spesifikk lengre bølgelengde som kan detekteres i en fotomultiplikaotr. Ved ikke-spesifikk deteksjon kan noen typer fluorokromer binde seg til dobbelttrådet DNA , eller i mer spesifikke deteksjon benyttes fluorescerende reporterprober. For prøver basert på RNA blir først RNA omdannet til komplementær DNA (cDNA) katalysert av revers transkriptase.
Revers transkiptase PCR (kvantitativ sanntids polymerase kjede reaksjon (qPCR)) blir brukt til å sekvensere RNA, for eksempel fra RNA-virus, hvor først RNA som templat blir oversatt til DNA, såkalt komplementært DNA (cDNA), katalysert av enzymet revers transkriptase. For enkelttrådet RNA-virus kan man bruke NASBA-metoden (nukleinsyresekvensbasert amplifisering) hvor RNA kobles sammen med (annilieres) spesialdesignete primere. Deretter blir RNA amplifisert (oppformert) isotermt ved 41oC til enkelttrådet RNA. En enzymblanding med T7 RNA polymerase, RNase H, samt revers transkriptase fra myeloblaster fra fugl (Aves) bruker RNA som oppskrift (templat) for å lage cDNA. RNase H bryter ned RNA-templatet og andre RNA som er bundet til cDNA, men bryter ikke ned enkelttrådet RNA. En ny primer festes i 5’-enden av cDNA og revers transkriptase lager en ny tråd, i et (+)cDNA-(-)RNA kompleks. RNA polymerase binder seg til promoter på dobbelttråden og transkriberer i 3’-5’retning slik at det stadig lages nye antisens-RNA.
Tidligere brukte man teknikken Northern blot for å kvantifiser RNA, men metoden krevende i både tid og arbeid og krevde store mengder RNA, og er nå erstattet av RT-PCR.
Historien om polymerase kjedereaksjon (PCR) - biologenes kjernereaksjon
DNA polymerase ble i 1955 isolert fra tarmbakterien Escherichia coli av Arthur Kornberg . Kornberg fikk nobelprisen i 1959 sammen med Ochoa. Severo Ochoa (1905-1993) hadde isolert en polynukleotid fosforylase. Kornberg og Ochoa oppdaget enzymer som kunne brukes til å lage nukleinsyrer in vitro. Gobind Khorana (1922-) var også av dem som førte fram ideen om en PCR-reaksjon. Imidertid var det Kary Banks Mullis (1944) som i1993 fikk nobelprisen i kjemi, og så muligheten som lå i PCR teknikken. Det trengtes en DNA primer, akkurat som man trengte noen få sukker for å kunne lage polysakkarider. De metodene som Kornberg og medarbeidere utviklet gjorde at man i 1970 kunne lage et syntetisk gen. DNA polymerase kan brukes til å bestemme sekvensen i et DNA molekyl og PCR teknikken er det motsatte av en sekvenseringsteknikk.
Fredrick Sanger hadde brukt 3 radioaktivt merkede nukleotider og en fjerde i begrensende mengder. Enzymet stoppet der hvor X skulle settes inn. DNA som skulle sekvenseres ble satt inn i en M13-fag der det er som enkelttrådet DNA. Rekombinant enkelttrådfagen isoleres og oligonukleotid komplementær til fag DNA virker som primer. Dessuten ble de tilsatt dideoksynukleotider, 4 nukleotider og 1 analog. Forsøket gjøres med 4 forskjellige analoger. Mullis brukte Sangers sekvenseringsteknikk. DNA polymerase fra en termofil bakterie som lever i varme kilder, Thermus aquaticus fra klasse Deinicocci, orden Thermales, er varmestabil (termostabil), Taq DNA polymerase, slik at man ikke behøvde å tilføre polymerase for hver forlengelsefase i PCR-reaksjonen. Kary Mullis fikk nobelprisen i kjemi i 1993 for oppdagelsen av PCR teknikken sammen med Michael Smith (1932-) for oppdagelsen av teknikken for stedspesifikk mutagenese.