Utgangsmaterialet er en løsning som inneholder mange kopier av enkelttrådet DNA av det molekylet som skal sekvenseres. Dette fordeles på fire testrør sammen med de vanlige deoksyribonukleotidene som er forkomponenter for DNA syntese (dATP, dCTP, dGTP og dTTP) sammen med DNA polymerase og korte stykker med enkelttrådet DNA som er komplementære til 3´-enden av DNA-tråden som skal sekvenseres. Disse sist nevnte DNA-stykkene fungerer som primere for å starte DNA-syntesen og er radioaktivt merket eller merket med fluorescerende fargestoffer. I tillegg inneholder de fire rørene henholdsvis en av de fire nukleotidene i dideoksyform (dd-) som gjør at veksten av DNA-kjedene stopper når det kommer til en av disse. Resultatet er en samling av delvis kopier av den originale sekvensen som stopper der hvor det er en av basene A, C, G eller T. Deretter kjøres det elektroforese på polyakrylamidgeler fra reaksjonsbladningene fra hvert av de fire rørene. I et elektrisk felt vil negativt ladet DNA bevege seg og hvor de minste fragmentene beveger seg raskest. Etter elektroforese synliggjøres de merkede oligonukleotidene på en film og sekvensen (A, C, T eller G) for den nysyntetiserte tråden kan leses av direkte av båndmønsteret nedenfra og oppover.
Siden dette ble skrevet har kapasiteten og metodene for DNA-sekvensering utviklet seg enormt blant annet nanoporesekvensering og merking av nukleotidene med fluorescerende stoffer som avleses med lasere.