Spektrofotometri

Målemetode hvor man bestemme mengden av et stoff eller stoffets egenskaper i en prøve plassert i en kuvette i et spektrofotometer.

Spektrofotometeret  er et måleinstrument som består av en lyskilde, wolframlampe for synlig lys (VIS) eller deuteriumlampe for ultrafiolettstråling (UV), hvor lyset deretter passerer fra lampen gjennom en spalte til et prisme eller gitter som deler opp lyset i forskjellig bølgelengder. Lys med en bestemt og utvalgt bølgelengde fra en monokromator går gjennom en spalte før lysstrålen treffer en kuvette med prøven. På motsatt side av kuvetten er det en fotomultiplikator som registrerer hvor mye lys som har kommet gjennom prøven. Man måler forholdet mellom mengden lys som kommer inn i prøven (Io) og mengden som kommer ut fra kuvetten (I). Noe av lyset blir absorbert av stoffet i prøven,  og noe av hva stoffet er løst i og av selve kuvetten. Vanligvis bruker man en silisiumdetektor for synlig lys og ultrafiolett stråling (UV-VIS), eller en blysulfiddetektor for kortbølget varmestråling (IR). I et prisme atskilles det forskjellige bølgelengdene ved brytning, men i et gitter som er en rekke parallelle linjer på et speil dannes lysspekteret ved diffraksjon. Glassprismer blir i moderne instrumenter erstattet av gitter.

Spektrofotometere finnes i to hovedtyper;

1. Enkelttstråleinstrument (fotometer) med en monokromator og plass til en prøvekuvette.

2. Dobbeltstråleinstrument med to monokromatorer  som gir to lysveier som passerer henholdsvis en prøvekuvette og referansekuvette.  

I spektrofotometert kan man måle % transmisjon eller absorbanse.

Transmisjon er forholdet mellom I og Io målt i %.

\(\frac{I}{I_0}\)

Absorbanse (A) er den vanlige (Briggske) logaritmen med grunntall 10 til forholdet mellom I0/I, som er proporsjonal med den molare ekstinksjonskoeffisienten epsilon (ε), konsentrasjonen c til stoffet i prøven og lysveien d. 

\(A=\log \frac{I_0}{I}=\epsilon c d\)

Absorbanse er et dimensjonsløst tall uten måleenhet. Den ekstinksjonskoeffisienten ε viser hvor mye av lyset ved en bestemt bølgelengde blir absorbert av stoffet i prøven, og blir brukt til å bestemme mengden stoff  i prøven i form av den molare ekstinksjonskoeffisienten.

Ved en gitt bølgelengde lambda (λ) av lyset som sendes inn i prøvekuvetten, bølgelengde målt i nanometer (nm), så vil lysabsorbsjonen være proporsjonal med konsentrasjonen (Beers lov) og proporsjonal med lengden av lysveien (Lamberts lov), til sammen Beer-Lamberts lov.

Endring i lysmengden gjennom prøven dI/I er:

\(\frac{dI}{I}=-kc\;dl\)

hvor k er en proporsjonalitetskoeffisient, c er konsentrasjon av stoffet per volumenhet i mol per liter,  og endring i lysveien er dl, minustegn fordi lysmengden reduseres ettersom det passerer prøven.

\(\int \limits_ {I_0}^I \frac{dI}{I}=-kc \int\limits_0^1 dl\)

hvor 0-1 er lengden av lysveien, som vanligvis er 1 cm.

\(\ln \frac{I}{I_0}=-kcl\)

\(\ln \frac{I_0}{I}=kcl\)

Omregning fra naturlige til Briggske logaritmer:

\(2.303\cdot \log \frac{I_0}{I}=kcl\)

\(\log \frac{I_0}{I}=\frac{k}{2.303}cl=\epsilon l c\)

Lager man en grafisk framstilling av konsentrasjon c på x-aksen og absorbanse A på y-aksen blir dette vanligvis en rett linje med stigningskoeffisient εl.

\(\epsilon =\frac{A}{lc}\)

slik at den molare ekstinksjonskoeffisienten får måleenheten M-1 cm-1.

Hvis man bruker ultrafiolett lys i spektrofotometeret må man benytte kvartskuvetter i stedet for glass- eller plastkuvetter, for eksempel ved måling av absorbanse ved 340 nm ved reduksjon eller oksidasjon av NAD(P)H katalysert av enzymene dehydrogenaser.

Et spektrofotometer har vanligvis mulighet til å måle absorbsjonen av et stoff ved forskjellige bølgelengder, for eksempel bølgelengdeområdet 400-800 nm, og på den måte lage et kontinuerlig absorbsjonsspekter av stoffet i prøven. Bølgelengdene hvor stoffet i prøven har maksimumstopper for absorbsjonen er nyttige i identifisering av stoffet løst i et spesielt løsemiddel, for eksempel klorofyll løst i aceton som gir et karakteristisk absorbsjonsspekter. Et differansespektrum angir forskjellen mellom to absorbsjonsspektra.

I et kolorimeter har man ikke gitter eventuelt prisme og monokromator for å plukke ut spesielle bølgelengder av lyset, men bruker i stedet lysfiltere som bare slipper igjennom spesielle bølgelengder med en viss båndbredde.

Hvis det er partikulært materiale i form av suspensjon eller kolloider i prøven gjelder ikke Beer-Lamberts lov siden refleksjon og spredning av lyset via Rayleighspredning og Tyndalleffekt gjør at en del av lyset som sendes inn i prøven ikke kommer fram til fotomultiplikatoren (detektoren). Turbidometri eller nefelometri gir tilsynelatende absorbsjon av suspensjoner. I noen spesielle spektrofotometere har man flyttet fotomultiplikatorene helt inntil prøvekuvette og referansekuvette slik at spredt lys også blir registrert. I et slikt spektrofotometer kan man måle in vivo absorbsjonsspektere for eksempel encellete alger i løsning.

Ved luminometri måler man lysutsendelse fra en prøve registrert av en fotomultiplikator for eksempel fra kjemoluminiscens (luminol + hydrogenperoksid (H2O2), enzymsystemet luciferin-luciferase + ATP, grønt fluorescerende protein eller blåttlysfluorescerende protein.

Spektroskopi

Spektroskopi er målemetoder med måleinstrumenter som anvender prinsippet om at atomkjerner, atomer eller molekyler kan absorbere (motta) og sende ut elektromagnetisk stråling (energi). Spektroskopi anvendes innen kjemi, biokjemi og astronomi.

Ved fluorescensspektroskopi har man en monokromator hvor man velger ut eksitasjonsbølgelengden  som skal eksitere stoffet i prøven og en monokromator hvor man velger ut emmisjonsbølgelengden for fluorescensen.

Ved IR-Ramanspektroskopi ser man på molekylære vibrasjon i nært infrarødt og infrarødt (NIR-IR) i bølgelengdeområdet 0.8 til 2.5 mikrometer (µm).

Ved elektronspinresonansspektroskopi (ESR) for måling av uparrete elektroner (radikaler), samt kjernemagnetisk resonansspektroskopi (NMR) benytter man mikrobølger (bølgelengde 400 µm-30 cm) og radiobølger med bølgelengde >100 cm.  

I atomabsorbsjonsspektrometri (AAS) kan man identifiser grunnstoffer ved å gjøre dem flyktige i en flamme og undersøke hvilke bølgelengder som blir absorbert eventuelt usendt fra grunnstoffet i plasmaform.

Ved optisk rotasjon dispersjon (ORD) kan man studere sekundærstrukturen til protein ut fra deres evne til å rotere planpolarisert lys. I sirkulær dikromisme (CD) kan man måle forskjellig absorbsjon av venstre og høyre sirkulært polarisert lys i optisk aktive biomolekyler. 

Andre spektroskopiske teknikker er gammaspektroskopi, gammaresonansspektrokopi, røntgenspektroskopi. Man kan også definere UV-VIS spektrofotometeri som en spektroskopisk teknikk.

Tilbake til hovedside

Publisert 5. sep. 2019 17:06 - Sist endret 6. sep. 2019 11:40