Historien om genetikk

Mennesket har alltid observert arvelighet, likhet mellom foreldre, barn og søsken. Hva bestemte om det ble gutt eller jente? Sår man bygg så høster man bygg.  Arvelighetsforskningens tidsalder startet med Gregor Mendel (1822-1884) som gjorde planmessige kryssingsforsøk mellom ulike sorter av erter og bønner.  Innbyrdes kryssing mellom hybrider gir i neste generasjon former med de opprinnelige karakterene forent på ny måte  etter spesielle tallforhold. Mendel vokste opp i Heizendorf i daværende Mähren (midt-Tsjekkoslovakia). Faren var interessert i fruktdyrking (pomologi), og Gregor lærte seg tidlig å pode og okulere. I 1843 ble Mendel novise i Königin-klostret i Brünn, det nåværende Brno i Tsjekkoslovakia, som på den tiden var et sentrum for kultur og vitenskap. Klosteret tilhørte augustinerstiftelsen St. Thomas. Mendel var glødende opptatt av naturforskning, og samlet frø til sine krysningsforsøk, bl.a. svever (Hieracium). Han gjorde målinger av grunnvannstand og studerte solflekker. Hans interesse for hagebruk gjorde at han også var birøkter og drev med krysning av bier.  Mendel var også en god sjakkspiller og viste anlegg for analytisk tenkning. Han ble ordinert til prest i 1847 og tok etter katolsk skikk navnet Gregor - Johann Gregor Mendel. Mendel studerte ved Universitetet i Wien i perioden 1851-1853 med fagene botanikk, zoologi, fysikk, matematikk, kjemi og geologi.Tilbake til Brünn var han en  tid lærer før han ble stiftsabbed, en ledende stilling med mye administrativt arbeid. Allerede som novise hadde Mendel fått anlegge et  forsøksanlegg for plantedyring i klosterhagen.  Mendel registrerte og noterte nøye sine oppdagelser, og gjorde nye krysningsforsøk for å være sikker på at han var kommet til riktige konklusjoner. I 1865 holdt han foredrag om sine oppdagelser i naturforskerforeningen i Brünn.  

Mendels banebrytende tallforhold fra kryssingsforsøk på erter Versuche über Pflanzenhybriden (Forsøk med plantehybrider) ble sendt som en meddelelse til det naturhistoriske selskap i Brünn i 1866, en forening han var leder av for i en periode: Proceedings of the Brünn Natural History Society (Verhandlungen des naturforschenden Vereines in Brünn). Betydningen av dette arbeidet ble ikke oppdaget i en tid preget av darwinistiske tankegang.  Mendel informerte botanikeren Carl Nägeli i München, men Nägeli betraktet det bare som en merkelig publikasjon. Mendel hadde valgt hageerter (Pisum sativum) som som sitt viktigste plantemateriale, med sorter som hadde iøyenfallende forskjeller. Han studerte noen få avvik i karakteregenskaper og så hvordan det gikk med disse egenskapene i de påfølgende generasjoner.  Erter har selvbefruktning. Da Mendel skulle krysse erteplanter fjernet han omhyggelig de uåpnede pollenbærerne, og krysset blomstene med pollen fra en erteplante med andre egenskaper. Avkommet i neste generasjon  framkom ved selvpollinering. De 7 egenskapene han undersøkte var høye (d) og lave (r) planter. Runde (d) og rynkete (r) erter. Gule  (d) og grønne (r) frøblad i ertene. Flat (d) og oppsvulmet avsnørt belg (r). Grønn (d) og gul (r) umoden belgfarge. Akselstilte (d) og endestilte (r) blomster. Mendel kalte egenskapene for faktorer. I parentes er angitt nåtidens fagtermer (d) og (r) for henholdsvis dominante og recessive egenskaper. Krysset f.eks. Mendel erteplanter som hadde henholdsvis konstant hvite og røde blomster fikk avkommet i første filialgenerasjon (F1) bare røde blomster. Rød farge er dominant i forhold til hvit. Hvit er en recessiv vikende egenskap. Selvpollinering av disse erteplantene ga i andre filialgenerasjon (F2) en blanding av planter med enten røde (ca. 3/4) eller hvite blomster (ca. 1/4). Nærmere studier viste at erteplantene med røde blomster er av to typer: 25 % dominante røde og 50 % urene dominante røde.  25 % er hvite.  Hvis Mendel krysset høye erteplanter med andre høye planter ble alt avkommet høye. Krysset han lave erteplanter med lave ble avkommet lave. Krysset han korte med lange ble alle i første filialgenerasjon lange, men krysset han plantene i første filial med hverandre fikk han forholdstallet 3:1 for høye og lave planter. For å kunne forklare dette antok han at hver av foreldrene inneholdt to faktorer, en for hver av den arvelige egenskapen høyde. Lignende resonnement brukt han for blomsterfarge, farge på frø og belg, endestilte og sidestilte blomster, og frøformen glatt eller rynket. En faktor blir arvet fra faren og en faktor fra moren. Mendel fant ut at en faktor maskerte utrykket av den andre faktoren når de var tilstede sammen, altså dominant versus recessiv.  Resultatene ble kjent som arvelovene. Resultatene med erter baserte seg på 355 krysninger og 12980 avkom. "Je grösser ihre Anzahl, desto genauer wird das bloss zufällige eliminert". Mendels første lov omhandler spalting av egenskapene og arveanleggenes selvstendighet. Informasjonen ligger i kjønnene, og de to faktorene for hver egenskap bli atskilt og ender i forskjellige celler hos hunnplanter og hannplanter. Andre arveloven tar for seg uavhengig sortering av arvegenskaper. Faktorer for et sett av uavhengige egenskaper fra morplanten og farplanten blir atskilt uavhengig av hverandre, og hver kjønnscelle får en tilfeldig samling av faktorer fra moren og faren. Mens Darwins arbeider raskt ble kjent ble Mendels epokegjørende arbeid oversett i 35 år. Etter at Mendel hadde gjort sine epokegjørende krysningsforsøk fortelles det at frøbiller som spiste opp ertene ble et problem. Mendel drev også krysningsforsøk med andre arter  som fioler, tistler, kongslys, bønner, levkøy, mais og svever. Svever var meget vanskelig materiale å arbeide med  siden de er apogame. Marikåpe og fjellkattefot har partogenese, men ingen plante var så velegnet som erter. Mendel ble hyllet ved begravelsen som prelat og velgjører, men ingen skjønte hvilken genial naturforsker som ble begravet. Mendel,  grunnleggeren av moderne arvelighetsforskning og gjennom nøyaktige beregninger oppdageren av lover for nedarving av egenskaper og som bærer hans navn.  Det ble reist et marmormonument over Mendel i 1910, og nederst på monumentet er det en knelende mann og kvinne som rekker hverandre sine hender.

     Gjenoppdagelsen av Mendels arbeid ble gjort, uavhengig av hverandre, av botanikerne Hugo Marie de Vries (1848-1935), en nederlender, og tyskerne Carl Erich Correns (1864-1933) og Erich von Tschermak (1871-1962), som studerte hybridisering hos planter. I samme bind av tidsskriftet  Berichte der Deutschen botanischen Gesellschaft (1900) redegjør de for sine oppdagelser Mendel forskningsresultater kunne forklare hva de fant. Correns  påviste ved krysningsforsøk med rødgallebær, som har egne hannplanter og hunnplanter, at avkommet får likt antall hann- og hunnplanter. Han sammenlignet med svartgallebær som har hann- og hunnblomster på samme plante. Correns studerte også hybridisering av mais, bønner, erter og liljer. Correns krysset rød- og hvitblomstret mirakelblomst Marabilis jalapa som hver hadde konstant avkom. Kryssingen gir planter med lyserøde blomster, uavhengig av om rød eller hvit var morplante. Disse lyserød ble selvbestøvet (selvpollinert) og  avkommet ble 1/4 røde, 2/4 lyserøde og 1/4  hvite. I F3 generasjonen gir de hvite og røde avkom med henholdsvis hvite og røde blomster, det er bare de lyserøde heterozygotene som kløyver i forholdet 1:2:1. Hybriden Aa har to typer gameter.   I tillegg gjorde Correns studier av selvsterilitet hos engkarse i 1913, bladvariegering og cytoplasmatisk arv. 

    Det skulle seinere vise seg at runde erter hadde mange vanlige stivelseskorn, og at rynkete erter hadde få og kantete (rynkete) stivelseskorn, og de allelene Mendel studerte var for et greiningsenzym i syntesen av stivelse. Rynkete erter laget mindre mengde stivelse, men desto mer sukker som gjorde at cellene svulmet opp pga. osmose, og når ertene tørket ble de rynkete. Man fant det samme hos mais som finnes i mange varieteter. Runde maiskorn har vanlig stivelse, mens rynkete og glassaktige maiskorn har et høyt sukkerinnhold, sukkermais. Allelene for høye og lave erteplanter skulle det vise seg kodet for et gen i synteseveien av plantehormonet gibberellin som påvirker strekningen av planter. Grønne erter skyldes et allel som gjør at klorofyllase ikke bryter ned klorofyll.

   En ny vitenskapsgren, mendelisme, dannet grunnlag for opprettelse av egne institutter hvor det ble arbeidet med arvelighetsforskning.  Før hadde det vært mange rare forestillinger om arv. Hvis en gravid kvinne så en hare kunne ungen få hareskår (Jfr. Knut Hamsun: Markens grøde). Hvis en øks stod i hoggestabben kunne det også gi hareskår. Brente en gravid kvinne seg kunne barnet få ildmerke. Tidligere skjulte sammenhenger materialiserte seg og ble forklart. Plante- og dyreforedling kunne bli mer målrettet. En hybrid eller bastard er betegnelsen på av kom fra krysning av heterozygote individer. Fra tidligere kjente man til bastarder fra dyr. Botanikerne bruker betegnelsen hybrid.  Man satte et kryss (X) mellom foreldrene, og er morplanten kjent settes denne først, ellers settes de alfabetisk. Foreldrene i første krysning kalles parentalgenerasjonen (P-generasjonen, l. parentes - forelder). Avkommet i første krysning kalles første filialgenerasjon (F1) (l. filius - sønn, filia - datter). Hvis F1-planter selvpollineres eller krysses innbyrdes kalles avkommet F2-generasjonen.   I 1910 ble Det Mendelska sällskapet stiftet i Lund i Sverige og som utga tidsskriftet Hereditas.

Hva går i arv ? 

Hva går i arv og hvordan blir arven overført til nye generasjoner ? Hva er årsak til variasjon hos fenotypen (gr. phaino - vise seg, framtoning) og genotypen (gr. gennao - avle) ? Genotypen er individets faste arvelige grunnlag og fundament, mens fenotypen er utseende som genotypen koder for. En organisme kan utvikle seg forskjellig avhengig av ytre forhold. En plante som settes i god jord med rikelig gjødsel og vann vokser seg stor og frodig, men når et individ av samme arten vokser på skrinn og tørr jord blir den liten, gulgrønn og stusselig. Planter som utvikles i mørke blir forskjellig fra dem som utvikles i lys. Næringstilgang og lys påvirker form.

     Når man deler en plantetue i to, er det selvsagt for oss at plantene som vokser opp fra tua blir like. I slik vegetativ formering er det større eller mindre plantedeler som gir opphav til en ny plante. Tidligere var det ikke selvsagt at det skulle kunne lages et avkom som lignet foreldrene etter en krysning med kjønnsceller.  På siste halvdel av 1800-tallet ble mikroskopiteknikkene forbedret med apokromatiske linser laget av Abbé, og nye fargestoffer som haemtoxylin, carmin og anilinfarger. Dette ga muligheten for studier av kromosomer. Pringsheim oppdaget i 1856 at sperm gikk inn i den hunnlige cellen. Bütschli så i 1873 to kjerner i et befruktet egg. I 1883 undersøkte den belgiske biologen og cytologen Edouard van Beneden rundormen Ascaris fra tarmen hos hester. Ascaris har bare to kromosomer, og Beneden så at hver av foreldrene bidro med ett kromosom. Boveri og Hertwig fant at reduksjonsdelingen også skjedde  i planter, først kalt maiosis.  Strasburger oppdaget i 1884 at en naken spermkjerne kan trenge inn i egget og fusjonere med kjernen. Strasburger innførte kjerneidioplasmateorien, det vil si arvemassen (idioplasma) er lokalisert i cellekjernen.  Franskmannen E.G. Balbiani, som ga navnet til Balbianiringer, observerte kromosomer i kjernen og kalte dem bâtonnets, staver, og de ble omdøpt til kromosomer i 1888.  Kromosom betyr fargelegeme, som kan gjøres synlige med spesielle fargeteknikker.

Kromosomteori - tiden er moden

Hva var Mendels faktorer ?  Den amerikanske biologen Walter Stanborough Sutton (1877-1916) arbeidet med celler fra gresshopper og kunne se i mikroskopet at homologe kromosomer i mitose og meiose ble atskilt. De arvelige enhetene Mendel postulerte oppførte seg som kromosomene ved meiose og befruktning.  Kromosomene hadde en karakteristisk form og det var bare det halve antallet i kjønnscellene. Sutton fant at diploide celler i testiklene hos greshoppe fante i to morfologisk like sett, hvert kromosom i homologe par. Ved meiose fant han bare ett kromosom fra hvert par Både Sutton og den tyske biologen Theodor Heinrich Boveri (1862-1915) var de første som i  begynnelsen av 1900-tallet  koblet atskillelse og kromosomene i første stadiet av meiosen med atskillelse  og uavhengig sortering av Mendels faktorer. Med forskjellige metoder kom de fram til samme konklusjon, kromosomene er den fysiske enheten for arv. Boveri brukte egg fra både sjøpiggsvin og Ascaris i sine studier, og fant at kromosomtallet ble halvert i kjønnscellene. Kromosomene er bærere av Mendels faktorer, og genene er fysiske enheter på kromosomene. Et locus er posisjonen et gen har på et krom og et allel (allelomorf) er variasjonen i uttrykket av et bestemt gen.

    Diploide planter har i kjernen ett sett av kromosomer fra egget og ett sett fra pollen. Kromosomene i mitosen er lettest å studere i meristematisk vev i skudd- og rotspisser. Celledeling i pollen og frøanlegg er imidlertid av en annen type, en reduksjonsdeling (meiose), hvor kromosomtallet blir halveret. Plantene består av vegetative somatiske celler (gr. soma - kropp) og kjønnsceller blir kalt gameter (gr. gamos - bryllupp). To gameter gir en zygote. I 1910 fant G.H. Shull en monoik plante av rød jonsokkblom blant dioike planter, og kunne gjøre kryssingsforsøk. Mendels faktorer måtte være kromosomer eller deler av kromosomer. Bateson hadde i 1906 sammenhengsgrupper med planter som støttet kromosomhypotesen. Edmund B. Wilson (1856-1938) ble en forkjemper for cellebiologien.  Wilsons monumentale verk The Cell in Development and Inheritance ble utgitt i 1896.  Nettie M. Stevens (1861-1912) gjorde mange undersøkelser av kjønnskromosomer hos insekter.

Den amerikanske biologen Thomas Hunt Morgan (1866-1945) ved Columbia universitetet var i begynnelsen  kritisk til Mendel. Morgan stilte spørsmålene om resultatene fra erter kunne overføres til andre organismer. Var kjønnsfaktoren dominant eller recessiv ? Kategoriene dominant og recessiv var ikke alltid like tydelig som hos Mendels høye eller lave erteplanter. Det fantes ikke noe bevis på Mendels postulerte faktorer. Endring i Morgans syn kom fra hans arbeid med bananfluer som forsøksmateriale. Bananfluene lever av sopp som vokser på frukt, og har 4 par kromosomer (3 par autosomer og 1 par kjønnskromosomer) som er lette å atskille i mikroskop. Bananfluene blir voksne på 12 dager, trives på en blanding av bananer i melkeflasker, og kan gi 30 generasjoner på ett år. Morgan forsøkte mange typer påvirkning som temperatur, syre og base for å fremskaffe mutasjoner. Et gjennombrudd kom i 1910 hvor han ved bruk av radioaktiv stråling kunne observere en fruktfluehann med hvite øyne, uten at han ville kalle den en ny art. De andre fluene hadde røde øyne, og så krysset han hannen med en hunnflue. Avkommet fikk bare røde øyne, men i neste generasjon dukket hvitøyde fluer opp igjen. Snart hadde han en rekke mutanter. Morgan publiserte The Mechanism of Mendelian Heredity i 1915, Physical Basis of Heredity i 1919, og  The Theory of the Gene i 1926.

Fluerommet til Morgan og medarbeidere  skapte en mekanistisk ramme rundt Mendels teori om arv. Morgan mente at gener er locus på kromosomer og koblede gener ligger på samme kromosom. Morgan  skrev boka Evolution and genetics som gjorde genetikk til et verktøy for å kunne forstå  arv og variasjon. Morgans oppdagelser var fullt på høyde med med Darwin og Mendels epokegjørende arbeider. Fluerommet til Morgan tiltrakk seg biologer fra alle deler av verden.

    Herman Joseph Muller (1890-1967), student hos Morgan, oppdaget overkrysning og den mutagene effekten til røntgenstråling, og kunne øke mutasjonsfrekvensen hos bananfluene betydelig. Noen gener er letalgener (Lethe - underverdens elv), gener som gjør at individet dør. Det var Wilhelm Conrad Röntgen som i sitt arbeid med katodestrålerøret hadde oppdaget røntgenstrålingen i 1896. Røntgenstrålene trenger gjennom vev og bein og sverter fotografisk film.  Muller var en periode i Sovjetunionen, invitert av den genetikeren Nikolai Vavilov, men måtte forlate landet etter å ha kritisert Lysenko. Muller kritiserte også atombombeprøver og unyttig bruk av røntgenstråling, som han visste ga mutasjoner.  Alfred Henry Sturtevant (1891-1970) som begynte å arbeide i Morgans laboratorium sammen med Calvin B. Bridges  (1889-1938) oppdaget at frekvensen for rekombinasjon henger sammen med avstanden mellom gener på kromosomene, grunnlaget for de første genkart. Lenking vil si at forskjellige gener som ligger etter hverandre på samme kromosom kan nedarves sammen. Bridges ble kreditert oppdagelsen av den hvitøyete bananfluehannen, og han oppdaget også at det kunne oppstå feil i atskillelsen av kromosomer under reduksjonsdelingen (meiosen). Mange gener kan påvirke samme karakter: øyefarge, vinform og kroppsfasong hos bananfluene. Painter fant i 1933 kjempestore spyttkjertelkromosomer med båndmønster hos bananfluene.

Bakteriofager -  molekylærbiologenes bananfluer

Tyskeren Max Delbrück (1906-1981) var elev av Bohr,  og arbeidet ved California Institute of Technology. Max Delbrück, som hadde doktorgrad i teoretisk kvantemekanikk, skiftet fagområde, gikk over til biologi, og var en av grunnleggerne av gruppen som arbeidet med bakteriofager. Fra fysikken var erfaringene at det er best å studere det enklest mulige system.  Kjente fysikere på den tiden var Niels Bohr, Otto Hahn, Lise Meitner og Wolfang Pauli. Max Delbrück klargjorde livssyklus til bakteriofager i 1939. De andre som var med å danne den såkalte bakteriofaggruppen var  Alfred D. Hershey (1908-1997) og Martha Chase (1927-2003) og Salvador Luria (1912-) . Bakteriofagene har et hode omgitt av kappeprotein med arvemateriale i form av DNA eller RNA, og en hale som virker som kanyle for å sprøyte nukleinsyrer inn i bakterier.  Fagene fester seg på utsiden av bakteriene og sender DNA inn i bakteriene. Bakteriofagene har kort generasjonstid, er lette å få til å vokse på agarskåler med bakterieceller. Hershey og Chase fulgte infeksjonsprosessen, og fant i 1952 at Escherichia coli bakteriene ble disorganisert av bakteriofagen T2. Først dyrket de bakteriene på et medium med radioaktivt 32- fosfor, seinere tilførte de T2 som fikk inkorporert ³²P i nukleinsyrene. Så dyrket de bakterier på radioaktivt 35-svovel og fagen fikk merket proteinkappen. Når radioaktivt ³²P tas opp blir det inkorporert i DNA, og radioaktiv ³⁵S- svovel blir inkorporert i svovelaminosyrene methionin og cystein som inngår i protein. De brukte deretter de to typene av fag til å infektere bakterier. Så fant de at proteinkappen ble igjen på utsiden av bakterien, mens DNA ble sendt inn i bakterien. Delbrück og Luria fant at bakterier kan oppnå resistens mot bakteriofager ved mutasjon. DNA er genetisk aktivt. Norton D. Zinder og Joshua Lederberg (1925-) fant at bakteriofager overfører genetisk informasjon fra en bakterie til en annen bakterie. Dette var introduksjonen til bakteriegenetikken. Lederberg oppdaget ekstrakromosomalt sirkulært DNA kalt plasmider. Den franske mikrobiolgen André Michael Lwoff (1902-1994) fant at bakteriofager kan være i en kryptisk lysogen form i bakterien, kalt profag. Profagen lever stille i genomet som et Asovende virus@.  Dette profagstadiet ble navngitt med den greske bokstaven lambda (λ). Under noen stressbetingelser, bl.a. ultrafiolett lys som påvirker DNA, kan den latente profagen våkne, bli vegetativ, formere seg og ødelegge vertscellen. Bakteriofagene kan deretter infektere nye bakterier. Andre eksempler på latente virus er herpes simplex- virus. Lwoff arbeidet sammen med Francois Jacob, og etterhvert også Elie Wollmann. Wollmann og Jacob studerte konjugasjon i bakterier (transduksjon). Ved bruk av en stamme Hfr (høy frekvens av rekombinasjon) av tarmbakterien Escherichia coli med høy mutasjonsrate kunne de ved bruk av Waring-blender og avbrudd av konjugasjonen til forskjellig tid finne ut hvor fag lambda befant seg.

H. Fraenkel-Conrat og R.C. Williams laget i 1956  tobakkmosaikkvirus fra nukleinsyre og protein. Matthew Stanley Meselson (1930-) og Franklin William Stahl (1929-) var amerikanske molekylærbiologer som i 1954 merket DNA i tarmbakterien E.coli med den tunge nitrogenisotopen ¹⁵N. Den tunge nitrogenisotopen ble inkorporert i basene i DNA. Ved sentrifugering av DNA i tetthetsgradient med cesiumklorid kunne de vise at DNA blir kopiert ved semikonservativ replikasjon, og at de to trådene i DNA beholder strukturen mellom celledelingene. Semikonservativ replikasjon betyr at hver av dattercellene får en DNA-tråd fra foreldercellen. På begynnelsen av 1960-tallet gjorde Meselson og Stahl, sammen med Brenner og Jacob, studier av mRNA i proteinsyntesen på ribosomene.

  Det er tre teknikker som blir viktige for biologiens videre utvikling: Det er 1) Svedbergs konstruksjonen av en ultrasentrifuge; 2) Elektroforese, som Arne Tiselius fikk nobelprisen for i 1948,  og 3) Kromatograferingsteknikken. I 1931 hadde Harold Urey laget en tung isotop av hydrogen, deuterium og det ble også mulig å lage anriket ¹⁵N. De tunge isotopene ble brukt av Rudolph Schoenheimer i metabolismestudier, men tunge isotoper er mer kompliserte å bruke. Radioisotoper laget i partikkelakselleratorer og radioaktiviteten kan lett måles i en Geigerteller. I 1940 kunne Martin Kamen og Samuel Ruben lage den radioaktive karbonisotopen ¹⁴C som ble av uvurderlig betydning for studiet av karbonmetabolismen i alle organismer. Andre viktige radioaktive isotoper som sendte ut β-partikler og ble brukt i biologisk forskning er svovelisotopen ³⁵S og fosforisotopen ³²P.

Det molekylære grunnlaget for arv - et gen er en kjemisk enhet

Molekylærbiologien omfatter strukturen og arkitekturen til biologiske molekyler. Biokjemien tar for seg hvordan biologiske molekyler samvirker i cellemetabolisme og arv, og genetikken forteller hvordan informasjon overføres fra en generasjon til den neste.  I løpet av 1960-tallet skjedde den en molekylarisering av biologien. På 1960- og 70-tallet ble enzymer renset og egenskapene deres beskrevet, men så ble fokus skiftet til genomene og nukleinsyrene

    Den sveitsiske kjemikeren Johann Friedrich Miescher (1844-1895) jobbet bl.a. i Hoppé-Seylers laboratorium i Tübingen. Han fant et stoff som ikke kunne brytes ned av proteaser og kalte det nuklein.  Det viste seg å være en syre, nukleinsyre,  oppdaget i 1869. Det biologiske materialet som ble brukt var sperm med store kjerner fra laks i Rhinen. Nuklein inneholdt karbon, hydrogen, oksygen, nitrogen og fosfor.

  På 1930-tallet kjente man til to typer nukleinsyrer,  deoksyribose nukleinsyre (DNA), og ribosenukleinsyre (RNA) med ribose i stedet for deoksyribose, og nukleinsyrer med uracil i stedet for thymin. På tidlig på 1940-tallet ble det klart at cellekjernen inneholder både RNA og DNA. Kolonnekromatografien ble videreutviklet av Martin og Synge. Denne metoden brukte Chargaff og Davidson i 1949 for å finne strukturen til DNA. De fant at mengden adenin (A) var lik mengden thymin (T) i en prøve, og mengden cytosin (C) var lik guanin (G). Men hvordan var AT og GC ordnet tredimensjonelt ? 

   Lungebetennelse kan skyldes bakterien Diplococcus pneumoniae. Denne bakterien finnes i forskjellige typer avhengig av om de har en polysakkaridkapsel rundt cellene eller ikke. Glatte skinnene bakteriekolonier med polysakkaridkapsel gir lungebetennelse, mens røffe uten denne kapselen gir ikke lungebetennelse.  Den britiske mikrobiologen Fredrick Griffith (1877-1955) fant i 1928 at døde Diplococcus bakterier kunne transformere levende ikke sykdomsfremkallende bakterier, men som etter transformasjonen ga sykdom.  I 1944 oppdager amerikaneren og bakteriologen Oswald Theodore Avery (1877-1955), Colin MacLeod (1909-), og Maclyn McCarthy (1911-), ved studier av pneumokokker, at det transformerende prinsipp er DNA. Det transformerende prinsipp ble ikke ødelagt av de proteinnedbrytende enzymene trypsin og chymotrypsin og heller ikke av ribonuklease, men det ble nedbrutt av Dnase. De fant at DNA kan overføres fra døde varmeinaktiverte bakterier til levende bakterier. DNA  kan transformere bakterier, og  DNA er bærer av arvbar genetisk informasjon. Det som blir arvet er ikke protein, men nukleinsyrer. Avery og medarbeideres oppdagelse  øket interessen for studier av DNA, noe som skulle føre fram til Crick og Watsons oppdagelse DNA-strukturen. Gener i form av DNA er termodynamisk sett kjemisk stabile, noe som er uvanlig  ut fra deres form og struktur. Erwin Schrödinger (1887-1961) skrev What is Life (1944), om hvordan informasjonen er stabil, hvordan den kan overføres til neste generasjon. Shrödinger trodde at informasjonen ble overført via aperiodiske krystaller.

    Francis Harry Compton Crick (1916-) kom til Cavendish laboratoriet ved Universitetet i  Cambridge, som var ledet av Max Perutz og Sir Lawrence Bragg. Wilhelm Röntgen oppdagen røntgenstrålene i 1895. Seinere fant man at når røntgenstråler sendes gjennom krystaller av stoffer dannes karakteristiske diffraksjonsmønstre av lys og mørke linjer og punkter. H.W. Bragg (1862-1942) og sønnen W.L. Bragg (1890-1971) utviklet en teori for røntgendiffraksjon av proteiner. John Kenddrew (1917-1997) og Max Perutz (1914-) studerte i Braggs laboratorium, og undersøkte den  tredimensjonal struktur til proteiner ved hjelp av røntgenkrystallografi. En annen røntgenkrystallografigruppe ved Kings College i London bestod av Maurice Hugh Frederick Wilkins (1916-) og Rosalind Elise Franklin  (1920-1958) og som studerte sturkturen nukleinsyrer. James Dewey Watson (1928-), student hos Luria, kom også til Cavendishlaboratoriet. Wilkins (1916-) hadde skaffet røntgenkrystallografidata  som viste at DNA måtte ha en heliksstruktur.

Rosalind Franklins  krystallografidata, viste at fosfat satt utenfor heliksen, noe som var viktig for oppdagelsen av DNA strukturen. Hun har først i ettertid blitt tilkjent en viktig del av æren for oppdagelsen av dobbeltheliksstrukturen i DNA. Rosalind Franklin studerte også kappeproteinet hos tobakksmosaikkvirus.  Erwin Chargaff bestemte tidlig på 1950-tallet at basene i DNA var adenin (A), cytosin (C), guanin (G) og thymin (T) og at det var like mengder AT og GC. Alexander Todd hadde vist at nukleinsyrer inneholder grupper med sukker og fosfat. Crick fant sammen med  Watson at DNA har to komplementære kjeder. Crick kjente også til at Linus Pauling (1901-1994) hadde oppdaget at aminosyrene i protein dannet en heliks, en molekylær korkopptrekker. Ved hjelp av Chargaffs oppdagelse kunne de lage en  modell av DNA som en dobbelspiral, med baser på innsiden i par holdt sammen med hydrogenbindinger. I 1953 skrev Crick sammen med  Watson den klassiske artikkelen A structure for Deoxyribose Nucleic acid i tidsskiftet  Nature april 1953 171 (1953) 737-738.  Watson, Crick og Wilkins delte i 1962 nobelprisen i  fysiologi og medisin. Watson skrev bøkene The Double Helix (1968); The Molecular Biology o the Gene (1965). Sammen med John Tooze og David Kurtz skrev Wilson boka The Molecular Biology of the Cell (1983). Sistnevnte brukte vi som lærebok på kurset  BB 384 Genteknikk ved Biologisk institutt, Universitetet i Oslo, som vi fikk igangsatt i 1984. Kurset fikk nummer 84 siden det ble påbegynt i 1984. På laboratorieøvelsene brukte vi  Maniatis  sin blåfargede Akokebok@ for molekylærbiologer: Molecular Cloning: A laboratory manual fra 1979, laget til et molekylærebiologikurs ved Cold Spring Harbor, ga oppskrift på alle teknikkene som trengtes til genteknologien. Kurset dekket et oppdemt behov og ble svært populært.

      Ved Pasteurinstituttet arbeidet François Jacob (1920-) og Jacques Lucien Monod (1910-1976) som dannet den franske molekylærbiologiske skole. De studerte hvordan en organisme kan kontrollere hvor mye protein den skal lage. De undersøkte enzymet β-galaktosidase fra tarmbakterien Escherichia coli, og lac-operonet. Enzymet som spalter melkesukker (laktose) blir bare laget når melkesukker er tilstede, et fenomen kalt enzyminduksjon. Laktose virker som et induserende stoff, og gener kan skrus av og på. Tanken ble skapt om at det måtte være tre hovedtyper av gener hos bakteriene: strukturgener som bestemmer aminosyrerekkefølgen i proteiner, reguleringsgener som lager repressorer, og  operatorgener hvor repressorene blir bundet.Teorien går ut på at repressoren blir bundet til en del av DNA-sekvensen, kalt operator, som ligger oppstrøms for genet som blir regulert. Tanken oppstod om at det måtte være et kortlevet intermediat mellom gen og protein, som skulle vise seg å være budbringer RNA (mRNA). Flere gener  sammen i et operon,  styrt av en promoter, kan overføres til mRNA. Teorien om operon ble utviklet av Jacob, Monod og Arthur Pardee (1921-).  Jacob,  André Lwoff (1902-1994) og  Monod delte nobelprisen i medisin og fysiologi i 1965 for arbeidet med kontroll av genuttrykk i bakterier. Jacob og Monod valgte atskilte forskningsveier. Monod studerte, sammen med Jean-Pierre Changeux og Jeffries Wyman, hvordan allosteriske enzymer blir regulert. Monod publiserte i 1971 boka Chance and Necessity som tok for seg biologiske og filosofiske betraktninger omkring alle former for liv. Tarmbakterien Escherichia coli stamme K12 ble mye brukt i eksperimentene og også K12(λ), som inneholdt et lambdavirus. Dette var ufarlige bakterier, selv om E.coli stamme O157:H7 i våre dager er blitt kjent for å gi alvorlige matforgiftninger.

Det sentrale dogme er rekkefølgen DNA 6 RNA 6protein, men Howard Temin (1934-1994), som studerte retrovirus, viste at det også var mulig å omdanne RNA til DNA. Det overbevisende bevis kom da David Baltimore (1938-) fant en revers transkriptase, et enzym som kan omdanne RNA til DNA.Temin, Baltimore og Renato Dulbecco (1914-) fikk nobelprisen i medisin og fysiologi i 1975 for oppdagelsen av sammenheng mellom tumorvirus og gener i cellen.

    Barbara McClintock (1902-1992) studerte maiskromosomer. Ringkromosomer blir dannet ved bro-brudd, og bruddene fester seg og danner ringer, publisert i Cold Spring Harbor Symposiet i 1951. McClintock oppdaget at det genetiske materialet ikke var så stabilt som man hadde trodd, og at kontrollelementer (transposoner) kan flytte seg rundt i genomet. Evelyn Fox Keller: skrev en biografi om Barbara Mc Clintcok: A feeling for the Organism (1983). Se  N.C Comfort: Genetics 140 (1995) 1161-1166.

  Arv blir ikke bare overført via kromosomene i cellekjernen. Ruth Sager (1918-1997) oppdager at kloroplaster inneholder sirkulært DNA, og Boris Ephrussi (1901-1997) finner at også mitokondrier  inneholder DNA. Dette gir enn cytoplasmatisk arv som ikke følger mendelsk genetikk.

Den nye tid - genenes tidsalder

Marshall W. Nirenberg (1927-) løste den genetiske koden ved å vise at tre baser (et kodon) på DNA koder for en aminosyre. Sammen med tyskeren Heinrich Matthaei klarte Nirenberg å lage syntetisk RNA med bare uridin, og de klarte å konstruere et system som laget fenylalanin.  Polyuridylsyre sammen med celleekstrakt ga polyfenylalanin. Snart ble koden oppdaget. Et kodon med 3 baser gir 64 mulige kombinasjoner, og en aminosyre kan kodes av flere forskjellige triplitter. Resultatene ble bekreftet av Har Gobind  Khorana (1922-) som fant en kjemisk metode for å lage polynukleotider med kjent sekvens. Khorana, Nirenberg og Robert William Holley (1922-1993) delte nobelprisen i medisin og fysiologi i 1968.  AUG er koden for start av translasjon, men koder også for aminosyren metionin. Derfor starter alle proteiner med metionin. Holley  bestemte basesekvesen i alanin transfer-RNA. Severo Ochoa (1905-1993) kom til samme resultat. Nordmennene Kjell Kleppe og Ruth Kleppe Aakvaag gjorde postdoktorstudier hos Khorana. I 1966 var alle kodene for aminosyrene dechiffrert. Genene avleses ved transkripsjon hvor gensekvensen blir transkribert til en komplementær tår med ribonukleinsyre (RNA) kalt mRNA (Budbærer RNA). RNA inneholder sukkeret ribose i stedet for deoksyribose som i DNA, og har uracil i stedet for thymin. Deretter blir informasjonen fra mRNA oversatt (translatert) til en aminosyresekvens i protein.

Den tredimensjonale strukturen til protein ga grunnlaget for spesifisitet. Hvordan utvikles mer kompliserte organismer ? Molekylærbiologen Sydney Brenner (1927-) begynte å bruke en nematode (Coenorhabiditis elegans), bestående av noen tusen celler, men som har et fullt utviklet nervesystem. Nematoden lever i jorda og spiser av planterøtter. Brenner kuttet nematoden i 20.000 tynne snitt som han studerte i elektronmikroskop. Det er ca. 100 gener som deltar for å lage nervesystemet i nematoden, men isolering av transkripsjonsregulerende proteiner var vanskelig.

   Studiet av genomet hos høyere organismer viste at det inneholder repeterte sekvenser med DNA. Gentranskripsjonen gir heterogent nukleært RNA (HnRNA) hvor bare en liten del kommer ut i cytoplasma som budbringer-RNA (mRNA). Eksoner blir omdannet til mRNA, men intronsekvensene som kan utgjøre  inntil 95 % av genet blir fjernet. Det er altså mosaikk DNA, skjøting og splittede gener. Skjøten mellom introner og eksoner er utsatt for mutasjoner

    Starten på genteknologien startet i 1972 med en artikkel i tidsskriftet PNAS skrevet av David Jackson, Robert Symons og Paul Berg (1926-) som omhandlet DNA fra et SV40 onkogen, og DNA fra endret fag lambda som ble satt inn i tarmbakterien Escherichia coli. Eksperimentene av denne type ble sett på som risikable med muligheter for spredning av virus og onkogener, og rekombinant DNA-teknikk kunne misbrukes.  Berg utviklet metoder som gjorde at bakterier kan ta opp fremmede gener, men gjorde samtidig oppmerksom på hvilke farer misbruk av rekombinant DNA-teknikk kunne medføre. Et åpent brev til tidsskriftet Science i juli 1974 underskrevet av bl.a. Berg, etterlyste retningslinjer for arbeid med rekombinant DNA.  Mange var redd for at det skulle skapes sykdomsfremkallende organismer som man ikke hadde kontroll over.  Berg fikk nobelprisen i kjemi i 1980 for utvikling av gentekniske metoder (rekombinant DNA teknikker) sammen med amerikaneren Walter Maxam Gilbert (1932-) og engelskmannen Frederick Sanger som hadde arbeidet med metoder for sekvensering av baser i DNA.  Gilbert fant kjemiske stoffer som spaltet DNA ved bestemte nukleotider. Sanger fant en enzymbasert teknikk for sekvensering basert på DNA polymerase og hemmere. Polyakrylamidelektroforese på tynne geler gjorde det mulig å sekvensere DNA.  Den kjemisk farmasøytiske industrien så  potensialet i de nye genteknikkene. Grunnlaget baserte seg på restriksjonsenzymer oppdaget og renset av sveitseren Werner Arber og amerikanerne Hamilton Othanel Smith (1931-) og Daniel Nathans (1928-).  Disse fikk nobelprisen i fysiologi og medisin i 1978 for dette arbeidet. Restriksjonsenzymene kan brukes til å kutte DNA-molekylet ved bestemte basesekvenser, og blir et viktig verktøy i utvikling av de nye genteknikkene. Muligheten til enzymatisk å kutte gener i DNA i spesifikke biter gjør det mulig å bestemme organiseringen og den kjemiske sammensetningen av gener.

    I 1978 kunne Michael Smith lage basespesifikke mutasjoner i DNA fra en bakteriofag, og sammen med A. Fehrst og G. Winter klarte han å lage store mengder av et protein med forutbestemt aminosyresekvens. Stanley Cohen (1922-) og Herbert W. Boyer (1936-) hadde laget et rekombinant plasmid som de satte inn i bakterieceller, og plasmidet formerte seg i bakterien. Cohen og Boyer søkte i 1974om patent på metoden for rekombinant DNA-teknikk. I tiden som fulgte kom det komme mange nye bioteknologipatenter.

   Tom Maniatis ved Harvard fant metoder som gjorde det mulig å komme fra protein tilbake til det tilsvarende gen. Ved å isolere mRNA for hemoglobin, og vha. en revers transkriptase kunne de lage kopi-DNA (cDNA) som ble satt inn i et plasmid eller fag lambda, og som deretter kunne plasseres inn i bakterier. Problemet var imidlertid at genet som ble satt inn manglet reguleringssignaler. David Hogness kunne kutte hele genomet tilfeldig med restriksjonsenzymer,  fragmentene ble satt inn i plasmider, og fag lambda og ble ført tilbake til bakterier. På denne måten blir det mulig å lage et genbibliotek for hele organismen. På samme vis kunne det lages et cDNA bibliotek basert på isolering av mRNA.

   Bakteriene ble fortynnet slik at de dannet enkeltkolonier på petriskåler. Kolonien med bakterier som inneholdt et utvalgt gen blir utvalgt med molekylær hybridisering. Bakteriekoloniene blir overført til nitrocellulosefilter og denaturert for å atskille DNA. Deretter blir filtrerpapiret inkubert med et DNA-fragment (cDNA) kalt gensøker (probe) som er radioaktivt merket. Dette fragmentet vil hybridisere , filteret blir vasket og lagt mot røntgenfilm. Deretter kan man gå tilbake til petriskålen og plukke ut bakteriekolonien som inneholder genet man er ute etter. Virus kan brukes som gentransportør (vektor). Interessante gensekvenser kan oppformeres ved molekylær kloning. Det er blitt isolert mange forskjellige restriksjonsenzymer, som kutter DNA på forskjellige steder, noe som gjør klipping og liming av gensekvenser mulig. Restriksjonsenzymenes naturlige oppgave er å beskytte bakteriene mot fremmed DNA. Agarose geler gir bedre muligheter for separasjon av DNA. Det ble utviklet mer effektive vektorer:

  I 1980 ble fremmed DNA satt inn i planteceller for første gang. Gensekvensene danner oppskriftsboka, men kan vi forstå språket ? Onkogener kontrollerer celledelingen, og lager proteiner som er nødvendig for celledeling. Gener som har sentral rolle i vekst og celledeling er konservert gjennom evolusjonen.

   Sidney Altman (1939-) og Thomas R. Cech (1947-) delte nobelprisen i kjemi i 1989 for oppdagelsen av at RNA ikke bare er et passivt bindeledd mellom DNA og protein, men at RNA også kan ha katalytisk aktivitet, kalt ribozym.