Klorofyllfluorescens

Lyseksitert klorofyll vil alltid sende ut noe av den absorberte lysenergien i form av rødfarget fluorescens, spesielt fra fotosystem II i fotosyntesen. Mengden fluorescens kan brukes som et mål på elektrontransport og i hvilken grad fotosystemet er utsatt for stress.

Fluorescens fra klorofyll

   Klorofyll i hvitt lys ser grønt ut fordi det absorberer mye blått og rødt lys. Når et kvant med rødt lys fanges opp av et klorofyllmolekyl fraktes et elektron fra grunnnivå til et eksitert nivå i en høyere energiorbital og etterlater seg et "hull". Blått lys gir en større eksitasjon pga av et mer energirikt kvant, men elektronet faller umiddelbart tilbake til det røde orbitalet, og den ekstra energien til det blå kvantet tapes som strålingsløs deeksitasjon. Eksitasjonsenergien brukes også til å drive de kjemiske reaksjonene i fotosyntesen (ATP og NADPH dannelse). Noe energi tapes som fluorescens. Fluorescens er hverken reflektert eller transmittert lys, det er lys som skapes på nytt. Fluorescenslyset er rødt uavhengig av hvilken lys som er brukt til å eksitere klorofyll, og det er mer mørkerødt enn det røde lyset som ble absorbert fordi varme tapes i det eksiterte stadiet (Stokes shift). Fluorescenslyset sendes ut igjen i løpet av 10-9  sekund. Andelen av eksitasjonsenergi som frigis som fluorescens in vivo er ca. 3-5 %. I en klorofyll-løsning er andelen større >30 %

Fluorescenslyset kan måles med en fotodiode, men den må konstruers slik at lyset som brukes til å drive fotosyntesen (aktinisk lys) ikke blir målt. Derfor er fotodioden dekket av optiske filtere som holder det aktiniske lyset ute. Fluorscensen er tilnærmet lik enten man bruker blått aktinisk lys og ser på fluorescens ved bølgelengde ca. 695 nanometer (nm) eller om man bruker rødt lys og ser på fluorescensen ved bølgelengdeca. 740 nm. Graden av fluorescens er påvirket av karbonassimilasjonen. Hvis det er faktorer som begrenser CO2 assimilasjonen så vil mer lysenergi gå tapt som fluorescens. Den første stabile elektronakseptoren i fotosystem II er den primære kinon-akseptoren QA. Når QA blir oksidert kan den motta elektroner fra reaksjonssenteret i fotosystem II (P680) Når alle QA er redusert kan det ikke lenger motta flere elektroner og andelen av klorofyll a eksitasjonsenergi som blir fjernet som fluorescens øker. Vi kan derfor snakke om qP (=qQ) quenching som er direkte relatert til oksidasjonsnivået av QA. QA holdes i oksidert form ved å overføre elektroner til NADP+ og videre til CO2. Derfor blir det en nær sammenheng mellom oksidasjonsviået til QA, fluorescens og CO2-assimilasjon. Minskning i fluorescensutbytte som et resultat av elektrontransport via QA kalles fotokjemisk quenching for å skille det fra ikke-fotokjemisk quenching som skyldes quenching fra oksidert plastoquionin (Qp), quenching fra State transitions (Qt) og quenhing fra fotoinhibering (Qi). Størstedelen av ikke-fotokjemisk quenching er høyenerginivå quenching qN (=qE) som er direkte relatert til protongradienten som utvikles over thylakoidmembranen som et resultat av lysfluksen. Ingen vet presis hovrdan dette skjer men det ser ut som kation-bytteprosessen hvor protoner og magnesium (Mg2+) deltar gir endringer i strukturen i tylkoidmembranen slik at det skjer et skifte i dissiperingen av eksitasjonsenergi fra fluorescens til varmetap via termiske kanaler. Når kloroplaster bestråles, fraktes protoner inn i tylakoidhulrommene som derved blir mer sur og stroma blir mer alkalisk. Denne protongradienten sammen med tilhørende membranpotensial gir den protondrivende kraften som skal til for å lage ATP ifølge Mitchells kjemiosmotiske teori. Protongradienten gir også et tilbakekoblingstrykk på elektrontransporten fordi det er mer vanskelig å dytte et proton inn et rom som allerede er fylt av protoner. Det er derfor elektrontransporten går raskere hvis den er frakoblet via detergenter som lager kunstige hull i thyltakoidmembranen eller som virker som proton-sluk. Elektrontransporten vil også gå raskere hvis den er koblet. Dette synes selvmotsigende ut, men hvis nok ADP og Pi tilføres vil protongradienten utlades via ATP-syntese. Dette er hvorfor qN/qE er koblet til CO2-assimilasjonen. Hvis CO2 blir raskt fiksert vil ATP forbruket være høyt, det vil være mye ADP og Pi som kan brukes til å utlade protongradienten. Når CO2 fikseringen går sakte vil protongradienten øke og det vil skje et skifte fra energidissipering som lys  til energidissipering som varme. Det vil si at hvis det er en stor protongradient vil qE også være høy og fluorescensen blir quenchet.

Fluorescens målt med PAM-fluorimeter

PAM fluorimeteret er basert på en type puls-amplitude-moduleringsprinsipp. Fluorescens fra prøven eksiteres med repterende pulser med frekvens 1.6 eller 100 kHz med 1 μsekunder pulsvarighet fra en lysemmiterende diode (LED). Det pulsede LED lyset med bølgelengdetopp 650 nm sendes gjennom et filter for å fjerne langbølget lys >680 nm. Et filter foran detektoren, en fotodiode, slipper bare gjennom lys med bølgelengde større enn 700 nm. Det pulsede fluorescenssignalet som mottas av fotodioden blir selektivt forsterket i en to-trinns pulsforsterker. Dette gir høy selektivitet for det pulsmodulerte signalet selv i nærvær av hvitt lys med høy lysintensitet. Samtidig kan man bruke målelys som er tilstrekkelig svakt til å registrere utbytte av mørkefluorescensen. Vi fiberoptikk belyses prøven med utvalgte lyskilder.

Analyser av quenching

Andelen av qQ og qE kan analyseres ved å tilføre DCMU som blokkerer reoksideringen av Qa. Ca. 15 μM DCMU til en kloroplastsuspensjon gir en rask økning i fluorescensen.

Modulert lys har blitt brukt hvor man gir en mettende lyspuls med jevne mellomrom på et normal kontinuerlig aktinisk lys som driver fotosyntesen. Det modulerte lyssystemet er opprinnelig konstruert av Screiber. Det brukes en modulert målelys som er så lite at planten nesten tror den er i mørke. En lock-in forsterker tunes inn på samme frekvens som moduleringen slik at all fluorescens som ikke er modulert utelates. Modulering kan skje via en roterende skive (chopper) med spalter eller en lysdiode som kan moduleres ved en elektrisk puls generator. Et mørkeadaptert blad eller kloroplastsuspensjon belyses med det svake målelyset og dette gir Fo, den såkalte initielle mørkefluorescensen. En enkel mettende puls gir den maksimale variable fluorescensen dvs. den fluorescensen som er når alle quenchemekanismer er lik 0. Deretter brukes aktinisk lys av ønsket lysfluks med pulser f.eks. 300 msek mettende lys som legges på hver 10-20 sek. Den variable fluorescensen Fv varierer mellom Fo og maksimum ((Fv)m. Hver mettende puls vil redusere alt QA  og som vil være tilnærmet lik (Fv)m. Deretter vil fluorescenstoppene bli mindre pga av quenching forårsaket av protongradienten, hvis det antas av Fo og (Fv)m ikke endrer seg, men dette gjelder ikke alltid.

Tilbake til hovedside

Publisert 14. des. 2018 14:18 - Sist endret 14. des. 2018 14:18