Enzymkomplekset nitrogenase inneholder enzymet dinitrogenase reduktase og dinitrogenase.
Elektroner fra substratet fraktes med redusert ferredoksin eller redusert flavodoksin. Enzymet katalyserer reaksjonen:
N2 + 16 ATP + 8 H+ + 8 e- → 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi.
Produksjon av dihygrogen (H2) fra to av de åtte elektronene pluss to protoner (H+) er en del av reaksjonsmekanismen. ATP inneholder bindingsenergi som senker aktiveringsenergien i reaksjonen, i tillegg til kjemiske energi ved hydrolyse av fosfoanhydridbindinger i ATP. Binding av ATP og hydrolyse av ATP gir konformasjonsendringer i enzymkomplekset som økerredokspotensialet fra 300 til 420 millivolt (mV). Dette gir en mer kraftig elektrondonor.
Et jernprotein (Fe4S4) gir elektroner til et molybden-jernprotein (Fe8S7). I det aktive sete på proteinet er cystein-histidin sentralt. En bireaksjon i nitrogenase er katalyttisk dannelse av hydrogen (H2) som gir et energitap hvis ikke hydrogen kan utnyttes av en opptakshydrogenase kodet av et hydrogenopptaksgen (hup). Nitrogenase er ikke spesifikk for substratet nitrogen, men kan også bruke cyanid og acetylen som substrat. Nitrogenase reduserer Acetylen (C2H2) til etylen (C2H4) som kan påvises ved gasskromatografering og brukes som et assay for nitrogenase. Nitrogenase i finnes i diazotrofe organismer med ca. 20 nif-gener.
Dinitrogen reduktase er en dimer i nitrogenasekomplekset som inneholder et jern-svovel (4Fe-4S) redokssenter som kan bli redusert eller oksidert. I tillegg inneholder hver subenhet av enzymet et bindingssete for ATP. Dinitrogen reduktase overfører elektroner til dinitrogenase.
Dintrogenase er en større del av nitrogenasekomplekset og består av fire subenheter i en tetramer (α2β2) som inneholder en jern-molybden kofaktor (Fe-Mo-kofaktor) og en fosfatklynge med et jernsvovelsenter (8Fe-7S) . Jern-molybden kofaktoren inneholder en jernsvovelklynge med jern, svovel og aminosyren cystein (7Fe8S), samt molybden (Mo), en sidekjede med aminosyren histidin og to oksygenatomer fra homocitrat. I noen tilfeller kan molybden være byttet ut med vanadium.
I frittlevende bakterier som Azotobacter er elektrontransporten frakoblet ATP syntest og på denne måten forbrukes store mengder oksygen. I nitrogenfikserende rhizobier og erteplanter sørger proteinet leghemoglobin i rotknollene for lav oksygentilførsel. Hos blågørnnbakterier er nitrogenase lokalisert i heterocyster.
Ved rikelig tilgang på ammonium (NH4+) skjer det represjon av nif-gener, siden det da ikke lenger er behov for den energikrevende nitrogenfikseringen.
På røttene hos bønner (Phaseolus vulgaris) er det nitrogenfikserende rhizobier i knoller på røttene som inneholder enzymet nitrogenase i bakteroider, omgitt av leghemoglobin som regulerer tilførsel av oksygen slik at ikke nitrogenase blir ødelagt.