Nitrogenfiksering

Det er tre hovedtyper nitrogenfiksering: biologisk nitrogenfiksering, nitrogenfiksering via lyn og fotokjemi i atmosfæren,  samt industriell nitrogenfiksering. 

Industriell nitrogenfiksering

Industriell nitrogenfiksering med Birkelandmetoden baserte seg på en elektrisk lysbue hvor det ble dannet oksidert nitrogen, og som all nitrogenfiksering behøvde man store mengder energi. Birkelandmetoden ble seinere erstattet av Haber-Bosch-metoden hvor nitrogen (N2) og hydrogen (H2)  omdannes katalytisk til ammoniakk (NH3) ved høy temperatur og høyt trykk (>200 atmosfærer) og gir mer enn 80⋅1012 g nitrogen år-1.

N2 + 3H2 → 2NH3

Hydrogen (H2) ble tidligere produsert fra elektrolyse av vann, men i dag blir hydrogen laget fra metan (CH4).

Nitrogenfiksering i atmosfærereaksjoner

Av naturlig nitrogenfiksering utgjør biologisk nitrogenfiksering ca. 90% (190⋅1012 g nitrogen år-1. Resten av den naturlige nitrogenfikseringen skjer ved lyn i tordenvær (8%), hvor blant annet atomært hydrogen (H) og oksygen (O) inngår:

OH• + H + O + N2 → HNO3

og fotokjemisk (2%) hvor det skjer oksidasjoner i atmosfæren via ozon (O3) og andre oksidative reaksjoner, blant annet hydroksylradikalet (OH•) :

NO + O3 → HNO3

Nitrogenfiksering forårsaket av lys i tordenvær virker etter det samme prinsippet som lysbue i Birkelandmetoden for nitrogenfiksering. Ved alle forbrenningsreaksjoner ved høy temperatur dannes det nitrogenoksider (NOx) og disse blir oksidert i atmosfæren til HNO3.

Biologisk nitrogenfiksering

Trippelbindingen i nitrogen (N2) er svært stabil slik at det trengs store mengder fri energi for å kunne utføre reaksjonen angitt nedenfor :

N2 + 8e- + 8H+ + 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi

Elektroner som trengs til nitrogenfiksering kommer via redusert ferredoksin (jern-svovelprotein) eller flavodoksin (flavoprotein). Nitrogenase behøver 16 mol ATP per mol N2 fiksert, og nitrogenase blir inaktivert av oksygen. Nitrogenase lager hydrogen (H2) som et biprodukt, men hydrogen blir i varierende grad resirkulert katalysert av en opptakshydrogenase, hvor elektroner og protoner i hydrogen blir brukt på nytt. Kofaktoren jern-molybden i nitrogenase binder homocitrat som er nødvendig for optimal katalyttisk aktivitet.  Homocitrat blir laget i planten, katalysert av det nodulspesifikke enzymet homocitrat syntase.

Biologisk nitrogenfiksering er energikrevende og trenger minst 960 kJ mol- N som fikseres. Nitrogenase er et enzymkompleks som bare finnes i nitrogenfikserende mikroorganismer, og består av et jernprotein (Fe protein, dinitrogen reduktase) og et større molybden-jernprotein som bruker molybdopterin som prostetisk gruppe og fungerer som en dinitrogenase. Jernproteinet består av to subenheter med jern-svovelklynge (4Fe 4S2-)mottar elektroner fra ferredoksin/flavodoksin. Jernproteinet blir irreversibelt inaktivert av oksygen på under ett minutt. Molybden-jernprotein består av fire subeneheter, hver subenhet med to MoFe-S klynger, og dette blir også inaktivert av oksygen. Ferredoksin er elektrondonor til jernprotein som hydrolyserer ATP og reduserer molybden-jernproteinet.  Jernproteinet overfører deretter elektroner til MoFe-proteinet koblet til hydrolyse av ATP. ATP kravet er stort, vanligvis fra 20-30 mol ATP per mol fiksert nitrogen.For hvert gram N som blir fiksert trengs opptil 15 g karbohydrat. Protonering av molybden er første trinnet i nitrogenfikseringen og da kan hydrogen (H2) frigis som et biprodukt. MoFe-proteinet binder N2 og H+ og danner NH3.  Opptil 25 % av elektronstrømmen gennom nitrogenase kan brukes til å lage dihydrogen (H2).

Effektiviteten til nitrogenfikseringen avhenger av i hvilken grad bakteriene klarer å ta hånd om utskilt hydrogen og refiksere det med en hydrogenopptak hydrogenase, som resirkulerer elektroner og protoner fra hydrogen:

H2 ⇔ 2H+ + 2e-

Molybden-jernproteinet kan også redusere andre stoffer f.eks. acetylen som blir omdannet til etylen. Bruk av acetylen som kunstig substrat er en viktig metode for å måle nitrogenaseaktivitet. Lystgass og azid er andre stoffer som enzymet kan redusere. Elektronene til nitrogenfikseringen kommer fra redusert ferredoksin.  Nitrogenase er ekstremt følsom for oksygen, og nitrogenfikserende organismer har valgt forskjellige strategier for å kontrollere og holde lav oksygenkonsentrasjon i nærheten av nitrogenase. Bakterier som lever under anaerobe forhold f.eks. Clostridium og den fotosyntetiske bakterien Rhodospirillum har løst problemet ved at de vokser på steder uten oksygen (anaerobt).

Bakterier kan også lage mikroaerofile omgivelser ved å bruke opp oksygen ved høy respirasjon, altså respiratorisk beskyttelse av nitrogenase f.eks. Azotobacter. Gloeotheca utfører fotosyntese om dagen og nitrogenfiksering om natten.  Nitrogenfikserende bakterier kan også leve i kolonier med en slimskjede som begrenser diffusjonen av oksygen. Nitrogenase kan beskyttes av mekaniske barrierer. Blågrønnbakterier som vokser i miljø med liten tilgang på ammonium f.eks. Anabaena har fysisk atskilt nitrogenase i heterocyster med hard vegg. Heterocystene har tykk vegg, mangler fotosystem II,  inneholder bare fotosystem I slik at fotosyntesen utvikler ikke oksygen i heterocystene. Blågrønnbakterier som mangler heterocyster kan bare fiksere nitrogen under anaerobe betingelser. Blågrønnbakterier kan fiksere nitrogen hos Gunnera (Nostoc),  Cycas, Macrozamia (Nostoc), bregner, vannbregnen Azolla (Anabaena) og levermoser. Stengelkjertler hos Gunnera utvikles uavhengig av blågrønnbakterien Nostoc.  Lungenever (Pulmonaria) fikserer nitrogen i symbiose med Nostoc, men generelt er  ikke-nitrogenfikserende grønnalger mest vanlig i symbiose med lav.

   Gras kan dannes assosiasjoner (pseudosymbiotisk) med frittlevende nitrogenfikserende bakterier i slekten Azospirillum, men disse danner ikke nitrogenfikserende knoller. Frittlevende nitrogenfikserende Azotobacter er mikroaerobe på grunn av høy respirasjon.

   Grampositive aktinomyceter fra slekten Frankia danner nitrogenfikserende symbiose, aktinorhiza,  med røttene på or (Alnus) og pors (Myrica gale), og hos Casuarina og Ceanothus.

Nitrogenfiksering kan bare utføres av prokaryote mikroorganismer  som er frittlevende eller i samliv med planter: Bakterier, aktinobakterier eller blågrønnbakterier utfører nitrogenfiksering. Luftens nitrogen omdannes til ammonium (NH4+) katalysert av enzymkomplekset nitrogenase. Nitrogenase-komplekset tåler ikke oksygen, og inneholder jern og molybden som kofaktorer.

Nitrogenfiksering kan skje hos frittlevende bakterier under mikroaerobe eller anaerobe forhold. Dette skjer i bakterier fra slektene Azotobacter, Beijerinckia, Clostridium, Bacillus, Klebsiella. Aerobe bakterier produserer slim, danner klumper eller har høy respirasjon for å fjerne oksygen fra nitrogenase.

Nitrogenfiksering kan også gjøres av fotosyntetiserende bakterier i slektene Chromatium og Rhodospirillum, eller blågrønnbakterier i slektene Anabaena, Nostoc, Lyngbya og Calothrix. Nitrogenfikseringen hos blågrønnbakterier skjer i store spesialceller med tykk vegg kalt heterocyster, som hindrer diffusjon av oksygen inn til nitrogenaseenzymet. Heterocystene har fotosyntese som bare drives av fotosystem I som ikke lager oksygen. Blågrønnbakteriene lever mutualistisk ekstracellulært i de nitrogenfikserende systemer hos nålkapselmoser f.eks. Anthoceros punctatus, levermoser f.eks. Blasia pusilla, lav f.eks. Peltigera, Nostoc i symbiose med vannbregnen Azolla, i cycadofytter med koralloide røtter f.eks. Macrozamia, eller  Nostoc som lever intracellulært i stammen hos angiospermer f.eks. Gunnera. Gunnera skiller ut karbohydratslim og Nostoc kommer inn i planten via kjertelhår, og lever i rotbarken (cortex). Blågrønnbakteriene lager store mengder hormogonier dvs. bevegelige filamenter under opprettelsen av symbiosen.

Azolla

Bilde Vannbregnen Azolla.

Vannbregnen Azolla utfører nitrogenfiksering i heterocyster hos blågrønnbakterien Nostoc azollae syn. Anabaena azollae som lever i små lommer i bladene. Azolla blir brukt til grønngjødsling av rismarker i Asia. Symbiosen mellom blågrønnbakterier og planter er mindre kompleks enn symbiose med planter hvor bakterien er en mikrosymbiont som lever i flercelletet strukturer (noduler) på røttene laget av planten.

Rhizobium og erteplanter

Rhizobier er bakterier fra slektene Rhizobium, Bradyrhizobium og Azorhizobium med en rekke underarter som danner rotnodulerende symbiose med arter i erteblomstfamilien, samt slekten Parasponia i hampfamilien (Cannabaceae).  Bakterien fester seg til rothårene via lektiner og rothårene begynner å krølle seg. Rhizobium kommer inn i planten via spissen på rothåret. Det er molekylær utveksling av informasjon mellom erteplanten og rhizobiene.  Flavonoider fra planten som har nitrogenmangel induserer uttrykk av nodulerende gener (Nod-gener) hos rhizobier. Flavonoider og NodD protein, en transkripsjonsfaktor gir uttrykk av Nod-gener. Noen Nod-gener koder for enzymer som lager noduleringsfaktorer (Nod-faktorer) som er lipokitinoligosakkarider (N-acetylglukosamin oligosakkarid med et fettsyreacylkjede festet til den ikke-reduserende enden. Lengden på fettsyren, grad av metning, samt tilleggsreaksjoner med glykosylering eller sulfatering er viktig for vertsspesifisiteten. Rhizobier festet til planterøttene skiller ut Nod-faktorer som gir respons i erteplanten, og blir registrert av noduleringsfaktorreseptorer i planten. Nodfaktorer gir åpning av kalsiumkanaler, stigning av kalsiumkonsentrasjon (Ca2+) i cytoplasma og kalsiumoscillasjoner, som en del av signalveien Nod-genene sitter på et stort Sym-plasmid, som også inneholder spesifisitetsgener som gjør at stammer av Rhizobium bare kan infektere bestemte arter. Plasmidet bærer også nitrogenfikserende gener (nif-gener).Nod-gener for nodulering kan være lokalisert til symbiosegenklynger.  Systemet ligner på det man finner hos Agrobacterium tumefasciens som gir krongalle, men ligner også på Myc-signalet i dannelse av mykorrhiza.  Rhizobier  får planten til å lage en infeksjonstråd som er en utvidelse  og invaginering av plasmamembranen, og som vokser inn i rotbarken. Rhizobier har også mulighet til å komme intercellulært inn i roten via sprekker i epidermis. Tetraploide celler i rotbark (cortex)  og pericykel stimuleres til å lage en rotknoll. Rotnodulen fra rotcortex har et nodulmeristem hvor plantehormoner som auxin, cytokinin, strigolakton og jasmonat deltar i veksten av rotnodulen og sammenkoblingen av ledningsvev i sentralsylinder og nodul. Bakteriene i plantecellene er omgitt av plantens plasmamembran, men i tillegg blir bakteriene omgitt av en peribakteroidmembran, noe som ligner endocytose.  Bakteriene lever i rotknollene (rotnodulene) i et deformert ikke- bevegelig stadium kalt bakteroider eller symbiosom. Til en visse grad kan man si at symbiosomer ligner kloroplaster og mitokondrier.  Bakteriene får næring fra planten i form av organiske syrer som malat og succinat, og ammonium (NH4+) fra bakteriodene reagerer med aminosyren glutamat, danner glutamin i en ATP-avhengig reaksjon, assimilert av enzymet glutamin syntase i planten. Erteplantene danner ikke noduler i nitrogenrik jord, bare hvis det er mangel på nitrogen,

Leghemoglobin , hem bundet til protein, i rotknollene binder oksygen og sørger for lav oksygenkonsentrasjon rundt enzymet nitrogenase. Leghomoglobin gir oksygen til oksidativ fosforylering.  Leghemoglobin ligner myoglobin og til en viss grad vårt hemoglobin, gir en rustrød farge hvis rotnodulene knuses og virker som en oksygenbuffer ved å skifte mellom oksidert (Fe3+) og redusert form (Fe2+). Noen erteplanter i tropiske strøk har nitrogenfikserende knoller på stengelen i stedet for på røttene infektert av Rhizobium som også inneholder bakterieklorofyll a.

Mange erteplanter er viktige landbruksplanter som bønner (Phaseolus) , erter (Pisum sativum), soyabønner (Glycine max), peanøtter (Arachis hypogeaea) , linser (Lens culinaris), og disse har egne stammer med rhizobier.

Bakteroid

Aktinobakterier

Streptomyces-lignende aktinobakterier av slekten Frankia kan fiksere nitrogen og danner utvekster (aktinorhiza)  på røttene av or (Alnus), pors (Myrica) og jerntre (Casuarina). Frankia lager hyfelignende filamenter med nitrogenase beskyttet i vesikler som danner en barriere mot oksygen. Azospirillum lipoferum er en nitrogenfikserende bakterie som lever i rotsonen hos tropiske gras.

Nitrogenfikserende knoller på or

Nitrogenfikserende knoller på or (Alnus) laget av aktinobakterier i slekten Frankia.

Alnus-Frankia symbiose

Bilde 1: Tverrsnitt av aktinorhiza hos gråor (Alnus incana) i symbiose med aktinomyceter i slekten Frankia.

Alnus-Frankia symbiose

Bilde 2: Tverrsnitt av aktinorhiza hos gråor (Alnus incana) i symbiose med aktinomyceter i slekten Frankia. Detaljer.

Alnus-Frankia symbiose

Bilde 3: Tverrsnitt av aktinorhiza hos gråor (Alnus incana) i symbiose med aktinomyceter i slekten Frankia. Detaljer.

Alnus-Frankia symbiose

Nitrogenfikserende modellplante

En art sneglebelg Medicago trunculata er små rasktvoksende planter med gule blomster som har selvpollinering. Arten i erteblomstenfamilien (Fabaceae) har 8 kromosomer (2n=16) og genomet er sekvensert (ca. 375 Mbp). Den nitrogenfikserende bakterien Sinorhizobium meliloti danner knoller på røttene. Høy nitratkonsentrasjon i jorden  hmmer noduldannelsen.

Medicago trunculata Genome Project

Genomet til rødkløver (Trifolium pratense), en annen nitrogenfikserende art, er også sekvensert.

Tilbake til hovedside

Publisert 4. feb. 2011 10:38 - Sist endret 12. mars 2019 08:50