Organismer som kan fiksere og utnytte dinitrogen (N2) som nitrogenkilde (N-kilde), kalles diazotrofe organismerm og alle er prokaryoter. Dinitrogen er et meget stabilt molekyl pga. trippelbindingen som holder de to nitrogenatomene sammen (N≡N). Biologisk nitrogenfiksering skjer ved hjelp i enzymkomplekset nitrogenase, som er et sammensatt molybden-jern-protein og jern-protein. Nitrogenase katalyserer følgende reaksjon hvor hydrogen (H2) er et biprodukt:
N2 + 16ATP + 8e- + 10 H+ → 2NH4+ + H2 + 16ADP + 16Pi
Energi i form av ATP kommer fra respirasjon av karbohydrater eller fra fotosyntese hos fotosyntetiserende organismer. Elektroner kommer fra redusert ferredoksin eller flavodoksin. Flavodoksiner inneholder ikke jern, men har flavin i stedet. Det er funnet en nitrogenase som bruker vanadium i stedet for molybden. I tillegg trenger enzymet magnesium (Mg2+). Enzymet blir ødelagt hvis det er oksygen tilstede. Nitrogenase kan også redusere andre stoffer f.eks. acetylen, hydrogencyanid, hydrogenazid, dinitrogenoksid og karbonmonoksid. Reduksjon av acetylen til etylen er et mye brukt assay for måling av nitrogenaseaktivitet basert på gasskromatografering.
Noen diazotrofe bakterier er frittlevende slik som Azospirillum, Actinobacter, Bacillus, og Klebsiella, og noen av disse kan leve i rotsonen (rhizosfæren) hos planter som rhizobakterier og koloniserer overflaten til røttene. Rothetta og de yngste delene av røttene skiller ut karbohydratslim og andre stoffer som gir en rik bakterieflora i tilknytning til røttene. De diazotrofe bakterieslektene Azoarcus, Herbaspirillum, og Gluconobacter kan også leve som endofytter inne i plantene. Den anaerobt fotosyntetiserende Rhodospirillum rubrum er nitrogenfikserende, og Clostridium pasteurianum, som er vanlig i jord, var den første anaerobe nitrogenfikserende bakterien som ble beskrevet. Anaerobe sulfatreduserende bakterier f. eks. Desulfovibrio kan fiksere nitrogen i marine sedimenter. Metanogene bakterier kan også være diazotrofe. Noen bakterier er mikroaerofile, dvs. de kan vokse i nærvær av oksygen, men bare ved lavt partialtrykk av oksygen. Mikroaerofile som kan fiksere nitrogen ved redusert oksygentilgang finnes hos bakterieslektene Azospirillum, Xanthobacter og Mycobacterium. Noen bakterier som f.eks. aerobe Azotobacter chroococcum beskytter nitrogenase mot oksygen ved å ha meget høy respirasjonsrate (respiratorisk beskyttelse). Aerobe nitrogenfikserende arter, f. eks. Beijerinckia, Klebsiella og Bradyrhizobium, skiller ofte ut store mengder geléaktige polysakkarider som hindrer oksygentilgangen til nitrogenase. Nitrogenfiksering hos blågrønnbakterier skjer i egne celler kalt heterocyster som ligger med jevne mellomrom langs filamentene. I heterocystene er det bare fotosystem I i fotosyntesen som ikke lager oksygen. Hydrogen er et biprodukt ved nitrogenfikseringen katalysert av hydrogenase som gir et energitap hvis den nitrogenfikserende organismen ikke har en reversibel hydrogenase til å refiksere tapt hydrogen. Molybdenmangel gir redusert nitrogenfiksering. Ammonium, nitrat, glutamin og arginin represserer nitrogenase.
Mange bakterier danner en del av mikrobiomet i planter, på samme måte som mikrobiomet er en del av alle organismer, inkludert menneske, hvor alle indre og ytre overflater er dekket med bakterier, i celleantall ca. lik antall kroppsceller. Filamentformete blågrønnbakterier (cyanobakterier)i slekten Nostoc inngår i symbiotisk mutualistisk samliv med lav. ca. 10% av lavene lever i symbiose med blågrønnbakterier, og de resterende i symbiose med grønnalger. Nostoc kan leve i slimfylte karbohydratrike kanaler hos levermoser (Blasia, Cavicularia). Nostoc azollae (syn. Anabaene azollae) lever i symbiose med flytebladplanten og vannbregnen Azolla. Nostoc i symbiose ved basis av bladstilken til Gunnera, eller i korallrøtter hos konglepalmer (Cycas, Zamia, Macrozamia, Ceratozamia). Siden nitrogenase blir hemmet av oksygen er skjer nitrogenfikseringen hos blågrønnbakterier i heterocyster, og som bare inneholder fotosystem I i fotosyntesen. Rhizobier er bakterier som danner nitrogenfikserende knoller på erteplanter. Aktinobakterier i slekten Frankia danner aktinorhiza på røttene til sammen med or (Alnus), pors (Myrica gale), tinnved (Hippophae rhamnoides), og sølvbusk (Elaeagnus). I symbiosen og opprettelse av kontakt mellom prokaryot og eukaryot skjer det en molekylær dialog og kjemisk kommunikasjon.