Replikasjonsgaffel
Replikasjonen har et stabilt startsted. Den engelske biokjemikeren John Cairns (1922-2018) lot på 1960-tallet bakterien Escherichia coli vokse med radioaktivt tritiummerket (3H) thymidine, som ble inkorporert og laget radioaktivt DNA. DNA ble isolert fra E.coli, lagt på røntgenfilm (autoradiografi) og den radioaktive strålingen fra DNA svertet filmen. Røntgenfilmen viste av bakterie-DNA var sirkulært, men i tillegg hadde det en løkke hvor Cairns antok at det måtte være en replikasjonsløkke hvor de to DNA-trådene i foreldre-DNA tvinner segut og begge trådene replikeres samtidig. «The bacterial chromosome and its manner of replication as seen by autoradiograph» (1963) . Seinere fant Cairns ut at det var to replikasjonsgafler I kromosomet og at de beveget seg I hver sin retning I det sirkulære bakterie-DNA. Dessuten kan DNA oppvise selektiv denaturering i områder som er rike på adenin-thymin (A-T) og at replikasjonen alltid starter på samme sted.
Den amerikanske biokjemikeren Arthur Kornberg (1918-2007) isolerte, renset og beskrev enzymet DNA polymerase som lager nytt DNA i bakterien E. coli (DNA-polymerase I), og som som katalyserer reaksjonen:
(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+ 1 + PPi (pyrofosfat)
hvor dNMP er dideoksynukleosid- 5’-monofosfat og dNTP er dideoksynukleosid-trifosfat.
Kornberg fikk nobelprisen i fysiologi eller medisin i 1959 sammen med Severo Ochoa for «for oppdagelse av mekanismen for biologisk syntese av ribonukleinsyre og deoksyribonukleinsyre». Det er vist seg at det finnes minst fem forskjellige DNA-polymerase, og DNA-polymerase III er viktigst i replikasjonen, mens de andre blant annet deltar i DNA-reparasjon. I tillegg finnes det et stort replisom i replikasjonsgaffelen med mange forskjellige enzymer som helikase, topoisomerase, DNA-primase, ligase, metylase m.fl.
Ny DNA-tråd lages alltid i 5’-3’-retningen, mens templatet avlese i 3’-5’-retningen. DNA-molekylet forlenges i enden med en fri hydroksylgruppe (3’OH), hvor den kobles til alfa-karbonet på dNTP. DNA-polymerase er avhengig av magnesium (Mg2+), hvor ett Mg2+ bindes til et proton (H+) på og det andre til trifosfat. Ledetråden i 3’-5’retningen lages kontinuerlig med nytt DNA i 5’-3’’retning, mens lagtråden 5’-3’retning kopieres i biter og motsatt vei, små stykker i 3’-5-retning, Hos eukaryoter består bitene av 100-200 nukleotider, mens hos prokaryoter kan de være opptil ti ganger så lange. DNA-polymerase trenger en primer som start på lagtråden, og som er komplementær til templatet med fri 3’-ende. På insersjonssete for dNTP på enzymet blir det laget en fosfordiesterbinding og nukleotidsekvensen har økt med 1.
DNA-polymerase utøver korrekturlesing under kopieringen og gjør få feil. Imidlertid, hvis det er en feil inneholder enzymet en 3’-5’eksonuklease som kutter ut det som er feil og setter inn nukleotider som stemmer overens med templatet.