Nuklease

Nuklease - Enzym som kan bryte fosfodiesterbinding i DNA eller RNA. Det er egne nukleaser som virker på henholdsvis DNA og RNA og de er spesifikke om de er istand til å kutte enkelttrådet eller dobbelttrådet nukleinsyre. Endonuklease kan kutte inne i nukleinsyremolekylet, eksonuklease kutter fra enden av molekylet. Restriksjonsendonukleaser kutter DNA ved en bestemt og spesifikk basesekvens. SI nuklease fra soppen Aspergillus oryzae kutter enkelttrådet DNA eller RNA. Se restriksjonsendonukleaser.

Nukleaser er enzymer som bryter fosfodiesterbindingen mellom nukleotidene i nukleinsyrene DNA (deoksyribonukleinsyre), deoksyribonuklease, eller RNA (ribonukleinsyre), ribonuklease (RNase). RNase kan bli brukt av bakterier i forsvar mot RNA-virus, hvor RNase degraderer RNA. Når pollenslangen ikke vil vokse på arret ved selvinkompatibilitet skyldes dette RNase i griffelen.

Det er to hovedtyper nuklease: endonuklease og eksonuklease. Restriksjonsenzymer er eksempler på endonukleaser. Eksoribonuklease fjerner nukleotider fra 5’-enden (5’-3’-eksonuklease)  eller 3’-enden (3’-5’eksoribonuklase)  av RNA molekylet.

  Et nukleotid består av et 5-karbonsukker, fosfatgruppe og en nitrogenbase. Nukleotider er flate molekyler som danner byggeblokkene i DNA og RNA.  Deoksyribose er sukker i DNA og ribose er sukker i RNA. Det er fem forskjellige nitrogenbaser som danner nukleotidene adenin (A), guanin (G), thymin (T), cytosin (C) og uracil (U). Uracil erstatter thymin i RNA. AT og GC danner basepar som har hydrogenbindinger mellom motsatte nukleinsyretråder. Nukleinsyrer er makromolekyler og biopolymerer. Informasjon ligger lagret i nukleinsyresekvensen (basesekvensen) som rekkefølgen av nukleotidene i DNA eller RNA. Alle celler inneholder DNA og RNA, unntatt røde blodceller, og virus inneholder enten DNA eller RNA. Nukleaser kan brukes til å kutte og lage en målrettet endring i nukleotidsekvensen ved et nuklease-indusert DNA-dobbeltbrudd,eller DNA-enkelttrådbrudd i et genlokus som ønskes modifisert. Et nuklease-indusert dobbeltbrudd kan skjøtes ved ikke-homolog endeskjøting (NHES) eller homologirettet reparasjon (HDR). Genomrearrangering kan skyldes basesubstitusjoner, translokasjoner eller insersjoner og delesjoner (indels) som kan gi mutasjoner som endrer leserammen i en gen. Indels som ikke er multiplum av tre basepar gir rammeskiftmutasjoner, og endrer leserammen i translasjon av sekvensen på ribosomet, og gir derved en annen aminosyresekvens i det nysyntetiserte proteinet. Det skjer lett rammeskiftmutasjoner i de repeterte sekvensene i genomet.

CRISPR Cas9

Det er blitt laget syntetiske nukleaser som blir brukt til å kutte DNA eller RNA, for eksempel meganukleaser, zinkfingernuklease (ZFN) og transkripsjonsaktivator-lignende effektor nuklease (TALEN).  Bakteriell CRISPR-assosiert RNA-styrt Cas 9-nuklease fra Streptococcus pyogenes kan bli brukt som en molekylærbiologisk teknikk til  geneditering og redigering for å lage et målrettet brudd i nukleotidsekvensen. CRISPR (klyngete regulært spredte repeterte korte palindromer, clustered regularly interspaced short palindromic repeats) brukes av bakterier under naturlige forhold som et adaptivt immunsystem for å beskytte seg mot fremmede nukleinsyrer fra plasmider eller bakterievirus (bakteriofager). CRSPR  er konservert under evolusjonen. Bakterier kan også beskytte seg mot bakteriofager ved å ha fag-induserte kromosomale øyer (PICI) kuttet ut av bakteriekromosomet som kan hindre replikasjon av bakteriofagene.

RNA interferens (RNAi) kan også bli brukt som forsvar mot fremmede nukleinsyrer. MikroRNA (miRNA) og små interfererende RNA (siRNA) er en viktig del av RNAi. Små RNA er genprodukter som hemmer genekspresjon ved å binde seg til eller deltar i nedbrytningen av spesifikke mRNA. RNA interferens  blir også kalt kosuppresjon eller posttranskripsjons genslukning ( silencing). Prosessen starter hos eukaryoter med enzymet DICER som kløyver dobbelttrådet RNA (dsRNA) i korte dsRNA, bestående av ca. 20 nukleotider, og disse spaltes til korte enkelttrådete RNA (ssRNA), hvor passasjertråden nedbrytes og den andre går inn i RNA indusert RISC (RNA-indusert silencing kompleks).  Dicer er en endoribonuklease i RNase III-familien og lager dobbelttrådet kutt. Dicer kan delta i epigenetisk silencing og i DNA-reparasjon.

Zinkfingernuklease (ZFN), TALEN og CRISPR-Cas brukt i planteforedling

Tradisjonell planteforedling er basert på krysning mellom arter, hybridisering, og kunstig seleksjon og utvalg av sorter med ønskede egenskaper. En flere tusen år gammel metode i domestisering av planter og dyr.  Dette er et arbeidskrevende med omfattende tilbakekrysning for å få rene homozygote linjer, og er spesielt krevende for polyploide planter. Imidlertid har det ledet til mindre genetisk variasjon i kulturplantene. En annen teknikk er å indusere tilfeldige mutasjoner i genomet til nytteplanter, og foreta seleksjon i mutantgenerasjoner. I arbeid med å utvikle sorter og genmodifiserte planter (GMO) som er resistente eller tolerante mot ugrasmidler brukes genmodifisering basert på Ti-plasmidet fra Agrobacterium. I de seinere år er det utviklet nye gentekniske metoder i planteforedling som anvender av zinkfingernuklease, TALEN (transkripsaktivatorlignende effektor nukleaser), og spesielt har bruk av genredigeringsverktøyet CRISPR fått økende interesse. Zinkfingernukleaser er kunstige sekvensspesifikke målrettede restriksjonsenzymer som kjenner igjen en tre basepar målsekvens. I de kunstige enzymene er et zinkfingerbindende domene (jfr. zinkfinger transkripsjonsfaktorer) koblet sammen med et DNA-kløyvende domene basert på restriksjonsenzymet Fok1 som kjenner igjen en spesiell nukleinsyresekvens i genomet som skal endres og modifiseres. Fok-1 finnes naturlig i bakterien Flavobacterium okeanokoites. Dobbelttrådbruddet fra nukleasen repareres via ikke-homolog eller homolog reparasjon, rekombinasjon og skjøting.

TALEN er på samme måte kunstige restriksjonsenzymer med et effektorbindende domene. TAL-effektor DNA-bindende domene er isolert fra bakterien Xanthomonas. Det kløyvende domene er fra restriksjonsenzymet og endonuklease Fok1. Talensekvensen blir satt inn i et plasmid som entrer cellekjernen i målcellen. ZFN, TALEN og CRISPR har blitt forsøkt anvendt innen genterapi.

Tilbake til hovedside

Publisert 4. feb. 2011 10:38 - Sist endret 17. aug. 2019 15:29