Små RNA

Små RNA består vanligvis av 21-24 nukleotider og kan slukke gener via RNA interferens og regulere genuttrykk. Alle små RNA blir laget fra dobbelttrådet RNA (dsRNA).

Dobbelttrådet DNA blir oversatt (transkribert) til enkelttrådet mRNA, hos eukaryotene dannes først et pre-mRNA som deretter blir prosessert. Fra mRNA bundet til ribosomer i cytoplasma og aminosyrer festet til tRNA blir den genetiske koden med basetripletter oversatt (translatert) til protein når aminosyrene kobles sammen. I tillegg har man oppdaget at små RNA molekyler deltar i genreguleringen.

Dobbelttrådet RNA blir laget ved folding av enkelttrådet RNA (ssRNA), eller via dupleks ved å koble seg til en komplementær ssRNA, eller via en RNA-avhengig RNA polymerase.   RNA-avhengig RNA polymerase kan lage dobbelttrådet RNA (dsRNA) fra enkelttrådet mRNA (ssmRNA). Dobbelttrådet RNA blir kløyvet via DICER eller DICER-ligngende (DCL) RNAase i biter på 21-24 nukleotider. Små RNA kan bli O-metylert i 3-terminal ende som gir beskyttelse mot uridylering og nedbrytning. De små RNA binder seg til ARGONAUT-protein (AGO) som inngår i RNA-indusert slukningskompleks (RISK). Ved komplementær baseparing kan RISK  binde seg til og modifisere både DNA (transkripsjonsregulering) og RNA (posttranskripsjonsregulering). Navn fra blekkspruten Argonauta. Hos både planter og dyr inneholder RISC et katalyttisk ARGONAUT-protein

 Små RNA finnes i hovedgruppene små interfererende RNA (siRNA) og mikro-RNA (mi-RNA).  RNA-styrt genslukking kan skje ved: 1) endring og modifisering av kromatinstrukturen via acetylering av histoner slik at transkripsjonen blir hemmet, 2) hemming av oversettelsen av mRNA til protein, eller 3) påvirke stabiliteten og nedbrytning av mRNA (posttranskripsjonsregulering).

Små RNA deltar i beskyttelse og forsvar mot angrep fra virus. Transposoner kan forflytte seg i genomet og små RNA kan blokkere for slik flytting, slukke og skru av aktiviteten til transposoner. Ved reproduksjonen kobles genomer fra to gameter i en zygote, en paternal og en maternal, og i hvilken grad allelene fra paternale og maternale gener blir uttrykt gir en form for preging. Det er også gunstig å slukke aktiviteten til transposoner i kjønnscellene, slik at transposonet ikke flytter seg inn i viktige gensekvenser.

Piwiassosiert RNA (piRNA) blir laget i kjønnscellene hos dyr.

Mikro-RNA (mi-RNA)

Mikro RNA (miRNA) deltar i en rekke utviklingsprosesser i planter. De deltar i bladutvikling og hva som skal bli bladoverside (adaksialt) og bladunderside (abaksialt) i dorsiventrale blad hos de tofrøbladete via transkripsjonsfaktoren PHABULOSA. miRNA deltar også i dannelse av det radiale mønsteret av ledningsstrenger, dannelse av adventivrøtter og siderøtter, og i overgangene embryonal-juvenil-adult-reproduktiv. Mikro-RNA blir laget fra ikke-proteinkodende MIR-gener. Det er kjent mer enn 300 forskjellige MIR-gener. Enzymet RNA-polymerase II transkriberer MIR-gener til et enkelttrådet RNA transkript. Transkriptet har en hårnålsløkke som gjør at enkelttrådet RNA via basekomplementering folder bakover seg selv og lager dobbelttrådet RNA. Imidlertid er det ingen perfekt selvkomplementering, slik at det blir dannet tredimensjonale dobbelttrådete løkker avgrenset av områder med enkelttråd.  Enzymene endonuklease DICER og DICER-lignende (DCL) kutter dobbelttrådet RNA til kortere mikro-RNA. Dyr trenger to enzymer for å lage miRNA, Drosha/pasha i cellekjernen og Dicer i cytoplasma. Mikro-RNA binder seg til transkripter fra andre gener med komplementær basesekvens. Resultatet er for eksempel at mRNA fra andre gener blir nedbrutt. Genene blir skrudd av og stengt for aktivitet,  en posttranskripsjons genslukking (silencing).Tofrøbladete planter har 4 forskjellige DCL-gener, og de enfrøbladete har 5 DCL.DCL1 lager miRNA med 22 nukleotider. DCL3 lager siRNA med 24 nukleotider.

Små interfererende RNA (si-RNA)

Små interferende RNA (siRNA)blir laget fra dobbelttrådet RNA via enzymet RNA-avhengig RNA polymerase. Små interferende RNA deltar i forsvaret mot patogener og slukker aktiviteten til transposoner. Det finnes også fasete og transvirkende si-RNA.

Oppdagelse av små RNA

De første forsøk med transgene planter ble gjort med petunia (Petunia hybrida) og tobakk (Nicotiana tabacum) i søtvierfamilien (Solanaceae), arter som er lette å transformere og oppformere via vevskultur. Noen av førsøkene med transgene planter var å endre fargen på kronbladene til petunia, ved å endre uttrykket av genet chs som koder for enzymet chalkon syntase, et sentralt enzym i biosyntesen av anthocyaniner som gir farge på blomstene. Det ble satt inn gener som laget sens transkript, det samme produktet som det endogene genet chs, men også transgen som laget et antisens transkript. Man forventet at antisens transkiptet skulle binde seg til endogent chs mRNA via baseparring, og hemme genuttrykket. Det overraskende var at også sens transkriptet hemmet uttrykket av det endogene genet. Man forventet at når man satte inn et ektra gen som kodet for chalkon syntase så skulle det bli laget ennå mer protein, men det motsatte skjedde. Mengden mRNA som kodet for chalkon syntase sank i begge tilfellene. Fenomet ble kalt kosuppresjon og var en genslukking (silencing) som skrudde av aktiviteten til gener. Det innsatte genet undertrykket uttrykket av det endogene genet ved å virke direkte på mRNA transkriptet, et fenoment kalt posttranskripsjons genslukking. Mekanismen er en form for beskyttelse mot fremmede nukleinsyrer. Man oppdaget at hvis man satte inn to forskjellige transgener med samme promotersekvens så ble DNA fra transgenet metylert og transkripsjonen blokkert, kalt transkripsjons genslukking.

RNA basert forsvar og beskyttelse mot plantevirus

Planter har forskjellig evne til å beskytte seg og være resistente mot angrep av virus. Planter som har blitt infektert med et virus og overlevd blir beskyttet mot påfølgende angrep fra det samme viruset. Dyr beskytter seg mot virus ved å øke produksjonen av antistoffer, men planter lager ikke antistoffer. Planter har en mekanisme som gjør at de kjenner igjen hele eller deler av virus-RNA, og resistente planter lager små interferende RNA (siRNA)  med en basesekvens som er komplementær til virus-RNA, og binder seg til og blokkerer dette. siRNA kan forflytte seg i planten via plasmodesmate og floemet, og spre seg systemisk og beskytte hele planten mot viruset. Man kan se likhetstrekk med systemet CRISPR-Cas systemet hos bakterier som gir beskyttelse mot bakterievirus (bakteriofager) og plasmider. Andrew Fire og Craig Mello vist at endogene gener hos modellorganismen og rundormen Caenorhabditis elegans kunne bli slukket og avskrudd via homologe dobbelttrådet RNA, såkalt RNA interferens genslukking via dobbelttrådet RNA.

ATP-avhengig remodelleringskompleks

Dobbelttrådet DNA og histonproteiner er tettpakket kromatin som gjør det mulig å ha store mengder DNA i cellekjernen i form av kromosomer. Tettpakkingen krever imidlertid at deler av kromatinet må blottlegges for at reguleringsproteiner og transkripsjonsfaktorer skal kunne komme i kontakt med DNA-sekvens. SWI/SNF kromatin remodelleringskompleks er en ATP-avhengig reaksjon hos eukaryotene som åpner opp kromatinstrukturen slik at DNA blir tilgjengelig for transkripsjon. Topologien og posisjonen til nukleosomene blir endret. Kromatinet får en ny modellstruktur.  Remodelleringskomplekset spiller en nøkkelrolle i regulering av vekst og utvikling. Som alle fundamentale kontrollmekanismer er den konservert under evolusjonen.  Hos planter deltar SWI/SNF i i samvirke med de fleste hormonregulerte prosesser i planter. Arabidopsis SPINDLY er en O-lenket N-acetyl-glukosamin transferase som deltar i signaloverføring fra gibberellin og cytokinin. SPINDLY N-acetylglukosamin transferase er som andre fundamentale kontrollmekanismer konservert under evolusjonen. Brahma (BMR) remodelleringsprotein spiller en nøkkelrolle i vekst og utvikling, bl.a. i cirkadiske rytmer.

Epigenetisk genregulering

Små RNA deltar i epigenetisk genregulering ved å kontrollere utviklingsprogrammer, og i beskyttelse mot virus og aktiviteten til transposoner. Store deler av genomet hos eukaryoter består av transposoner og retrotransposoner. De fleste av dem er inaktive grunnet mutasjoner, men mange er aktive og kan forflytte seg i genomet, spesielt hvis planten er utsatt for abiotisk eller biotisk stress.

DNA-metylase lager en kovalent binding mellom en metylgruppe og cytosin (C). Metyleringen hemmer genuttrykk (genekspresjon) ved å påvirke binding av transkripsjonsproteinkomplekser.  Flyttemekanismen til transposoner kan bli avskrudd vai CG-metylering. I noen tilfeller kan metyleringen gi økt transkripsjon.

Histonmonomere har lange N-terminale haler som kan bli acetylert, påhektet en acetyl-gruppe, katalysert av histon acetyltransferase. Acetyleringen gir svakere tiltrekningskrefter mellom histonprotein og DNA, som resulterer i løsere struktur, lettere binding av RNA polymerase og økt transkripsjon. Histon deacetylase fjerner acetyleringen, og minsker derved transkripsjonen.  I tillegg til acetylering av histoner, kan histoner bli metylert ved påhekting av metylgrupper på aminosyren lysin. Modifisering av histoner via acetylering og metylering gir en histonkode. Grad av metylering kan gi aktivering eller hemming av transkripsjonen. Histonkoden H3K27me3 betyr at aminosyren lysin (K) i posisjon 27 på histon H3 er påhektet tre metylgrupper (me3), og en slik kode kan gi genslukking. Noen proteiner bruker ATP for å endre interaksjonen mellom histoner og DNA. For eksempel BRAHMA (BRM) med ATPase og SPLAYED (SYD) hos bananflue (Drosophila melanogaster), også funnet i planter, sammen med SWI/SNF (Switch – sucrose non-fermentable) opprinnlig funnet i bakegjær (Saccharomyces cerevisae). Brahama er skaperguden i Hinduismen.

Det mest kjente eksemplet på epigenetisk regulering er vernalisering  hos vinterettårige og toårige planter hvor det er både eksogene og endogene signaler som deltar i blomstringsinduksjonen.  Effekten av den lave temperaturen med en kuldeperiode opptil 3 måneder eller mer påvirker blomstringslokus C (FLC, flowering locus C) som koder for en MADS-boks transkripsjonsfaktor som binder seg til og blokkerer (represserer) genet FT for blomstringslokus T som aktiverer blomstring. Den lave temperaturen gir DNA-metylering og FLC blokkerer ikke lenger FT. Stress resulterer i epigenetisk genregulering. For eksempel vil tørke og lav luftfuktighet resultere i at det dannes fære spalteåpninger på bladene. Stressindusert aktivering av transposoner skjer også via metylering og demetylering.

Eukaryot heterokromatin er tettpakket dobbelttrådet DNA tvunnet omkring en oktamer med histoner i form av nukleosomer, ca. 147 basepar (bp) per nukleosom. Heterokromatin inneholder centromeren med tilhørende repeterte sekvenser (pericentromerisk region), transposoner, repeterte sekvenser og gener for ribosomalt RNA (rRNA). Aktiviteten til transposoner er slukket via DNA-metylering eller histon-modifisering, og i det stille stadiet deltar små interferende RNA (siRNA). Eukromatin er mindre tettpakket, og er mer åpen for transkripsjon av gener. Pakkingen i form av kromosomer varierer i hvilket stadium av cellesyklus cellen befinner seg.

Litteratur

Wikipedia

 

Publisert 5. juli 2017 13:36 - Sist endret 31. jan. 2018 14:47