Kromatografering

Kromatografering (gr. chroma - farge; graphein - skrive) - Teknikk for å atskille stoffer med forskjellige egenskaper. Baserer seg på stoffers forskjellige evne til å løse og binde seg i en stasjonær og en mobil fase (væske eller gass). Bindingen kan basere seg på ladninger (ionebytterkromatografi), grad av polaritet (hydrofob interaksjonskromatografi), og evne til å binde spesifikt til grupper som er festet kovalent til et matriks (affinitetskromatografi). Gelfiltrering skiller molekyler med forskjellige størrelse.

Det finnes en rekke kromatografiske teknikker: kolonnekromatografi, væskekromatografi, tynnsjiktkromatografi (TLC), gasskromatografi (GC), papirkromatografi, høytrykksvæskekromatografi (HPLC). Elektroforese er også en kromatografisk teknikk.

Høytrykksvæskekromatografi

HPLC

Høytrykksvæskekromatograf (HPLC). Nederst til venstre to pumper som kan pumpe to forskjellige løsninger og lage konsentrasjonsgradienter som sendes gjennom HPLC-kolonnen som man ser mellom de to instrumenttårn. Over de to pumpene en UV-VIS detektor som virker som et spektrofotometer som kan måle absorbanse i prøven ved utvalgte bølgelengder i ultrafiolett (UV) og i synlig lys (VIS). Ultrafiolett stråling kommer fra en deuteriumlampe. For eksempel til atskillelse av fotosyntesepigmenter. Øverst til venstre en fluorescensdetektor hvor man kan velge forskjellige bølgelengder for eksitasjon av prøven (eksitasjonsbølgelengder), samt velge ut hvilke bølgelengder man ønsker måle fluorescenslyset (emmisjonsbølgelengde), for eksempel OPA-derivater av aminosyrer. Nederst til høyre en autoinjektor for automatisk uttak av prøver. Over denne styringsenheten for hele kromatografen, og øverst en elektrokjemisk detektor som ved utvalgt spenning spesifikt kan velge ut stoffer som reagerer, for eksempel hydroksylerte fenoler, slik som når acetylsyre reagerer med hydroksylradikaler (OH·). Instrumentet vesentlig finansiert via et ozonprosjekt på slutten av 1980-tallet. Lengst til høyre sto en integrator hvor man kunne integrere opp mengden stoff i de atskilte forbindelse, eller ved brukt av en vanlig potensiometerskriver og manuell beregning av arealer. Kromatografen står i tilknytning til et avtrekk (avsug) når man bruker organiske løsemidler. Biologisk institutt, UiO.  

Gasskromatografi

Gasskromatograf

Gasskromatograf (GC) med flammeionisasjonsdetektor (FID) og to injektorer hvor prøven føres gjennom et septum og inn i en kolonne ved hjelp av en sprøyte Flammen kommer fra en blanding med hydrogen og luft. Bæregassen som går gjennom kolonnen an for eksempel være nitrogen (N2) grad III eller helium. Botanisk institutt, UiO, hadde to slike, en med hotwiredetektor alternativt NPD-detektor.  

Ovnen i en gasskromatograf

En kolonne i ovnen som kan temperaturreguleres. Denne kolonnen ble brukt til å atskille hydrokarboner slik som metan, etan, etylen (eten), propan, butan og acetylen. Med en splitinjektor ble gasskromatografen brukt til kapillar GC, blant annet brukt til å studere produksjonen av geosmin hos blågrønnbakterier og aktinobakterier, med borneol som indre standard.  

Kolonner til gasskromatografering

GC-kolonner i rustfritt stål eller glass.

Kapillarkolonner GC

Kapillarkolonner til gasskromatografering. Med splitinjektor er det bare en liten del av prøven som går inn i den tynne lange glasskolonnen.

Kolonnekromatografi

Atskillelse og rensing av proteiner med kolonnekromatografi hvor proteiner og molekyler ble atskilt etter størrelse eluert fra kolonner med for eksempel Sephadex-G25, G-100 og G-200. Fraksjonene blir samlet opp i en fraksjonssamler. 

Proteiner blir også atskilte ved ionebytterkromatografi etter deres ladning eller isoelektrisk punkt. Affinitetskromatografi gir mer spesifikk binding mellom det stoffet som ønskes isolert og kolonnematerialet.

Gelelektroforese

Gelelektroforese brukes til å atskille stoffer i et elektrisk felt mellom anode og katode (polyakrylamid gelelektroforese, agarose gelelektroforese). Gelelektroforese blir brukt til å atskille forskjellige former og størrelser av DNA, RNA eller protein, en forutsetning for utvikling av molekylærbiologien. I papirelektroforese brukes papir som medium i stedet for agarose eller akrylamid.

Historie om kromatografering

Kromatografering ble første gang utført av den russiske botanikeren Mikhail Semenovitsj Tswett (1872-1919) hvor han kunne atskille en blanding av fotosyntesepigmenter fra et blad i en glasskolonne med et pulver med aluminiumoksid eller kalsiumkarbonat. Pigmentene ble eluert ut med et organisk løsningsmiddel (bensin),  og basert på løselighet og festing til kolonnepulveret ble pigmentene (grønnfarget klorofyll, gule og oransje karotenoider)  atskilt. Teknikken ble tatt i bruk av av den kjemikeren Richard Martin Willstätter (1872-1942) som i stedet for glasskolonner brukte papir for å atskille plantepigmenter for å kunne studere deres egenskaper (Nobelpris i kjemi 1915).  Willstätter studerte strukturen til alkaloider, inkludert kokain, og fant at klorofyll består av klorofyll a og klorofyll b.  To engelske biokjemikere Archer John Porter  Martin (1910-2002) og Richard Laurence Millington Synge (1914-1994)  videreutviklet teknikken med todimensjonal papirkromatografering på filtrerpapir. Martin og Synge fikk i 1952 nobelprisen i kjemi for oppdagelse av fordelingskromatografien.

Kromatografering har spilt en fundamental viktig rolle i utviklingen av biokjemisk og biomedisinsk vitenskap. Todimensjonal papirelektroforese av radioaktive 14C-merkete forbindelser, etterfulgt av autoradiografi og sverting av røntgenfilmen var metoden Calvin og medarbeidere brukte i oppdagelsen av karbonreaksjonen i fotosyntesen (Calvin syklus, reduktiv pentosefosfatvei).

Tilbake til hovedside

Publisert 4. feb. 2011 10:31 - Sist endret 9. jan. 2020 14:32