Bakterietelling

Telling av antall bakterier i en populasjon, anvendt innen næringsmiddel- og vann-hygiene, samt innen helsesektoren.

Bakterien Escherichia coli indikerer at vannet er forurenset av tarmbakterier fra mennesker eller dyr, såkalte koliforme bakterier. Intestinale enterokokker er mer tolerante og lever lenger enn de koliforme bakteriene. Termotolerante bakterier har sporer som overlever oppvarming, for eksempel Clostridium perfingens og arter Bacillus. Kimtallet eller bakterieantallet er totalantallet målt som MPN (Most probable number) eller som cfu (kolonidannende enhet). Grenseverdier kan være 1cfu/100 ml = 1 MPN/100 ml. Bakterier forekommer i meget stort antall i tusentall til mange millioner per milliliter, slik at man må ta ut en liten prøve fra bakteriepopulasjonen og fortynne denne.  For å få et velegnet antall å telle lager man en forsynningsserie (fortynningsrekke)  med samme vekstmedium, og antall bakterier mulipliseres med fortynningsfaktoren.

For eksempel følgende som utføres i et sterilkabinett og sterilt autoklavert vekstmedium:

Prøve A:  Aseptisk pipettert tar man ut 1 ml av bakterieprøven  og  tilsetter 9 ml vekstmedium i et rør, noe som gir 10 gangers fortynning (10x). Antallet bakterier er nå 1/10 av den opprinnelige. Deretter fortsetter man med 10x fortynninger og reduserer celleantallet i tierpotenser i forhold til den opprinnelige prøven.

Prøve B: 1 ml prøve A + 9 ml medium gir 1:100

Prøve C: 1 ml prøve B + 9 ml medium gir 1:1000

Prøve D: 1 ml prøve C + 9 ml medium gir 1:10000

Prøve E: 1 ml prøve D + t ml medium gir 1:100000

På en petriskål med agarmedium inokulerer man 0.5 ml prøve E og med en flammesterilisert glassbøyle plater man ut slik at prøven blir spredd jevnt spredd utover hele agarflaten. Deretter settes petriskålen i et varmeskap for inkubering, for eksempel 37oC, og etter for eksempel etter 24-48 timer telles antall bakteriekolonier på skålen. Inkubering kan skje aerobt eller anaerobt hvis man vil ha vekst av obligate anaerobe bakterier. En bakteriecelle gir en bakteriekoloni.  Metoden skiller levende fra døde bakterier. Hvis man for eksempel teller 50 bakteriekolonier  blir bakterieantallet 10 millioner bakterier per ml.:

\(Bakterieantall = \frac {Antall \; bakteriekolonier \cdot forytnningsfaktoren } {Volum \; av\; prøve}\)

Man kan også starte med å overføre 0.5 ml prøve E til en stertil petriskål  og tilsette smeltet agar i vekstmedium som er avkjølt til ca. 50oC. Hver bakteriecelle gir en bakteriekoloni. En passende fortynning gir 30 – 300 kolonier per skål. Agarplatene med bakteriekolonier kan telles manuelt med penn og klikkteller. Er det mange kolonier teller man bare en bestemt del av platen. Man kan også bruke en en elektronisk koloniteller, eller fra elektroniske bilder bruke gratisprogrammet ImageJ.

Oppkonsentrering ved sentrifugering eller membranfiltrering

Hvis bakterieantall i et inokulum i utgangspunktet er meget lavt med det foretas en oppkonsentrering enten ved sentrifugering hvor man løser pelleten i en mindre volum. Et annet alternativ er å bruke membranfiltrering hvor for eksempel 100 ml vannprøve helles i en en sterilisert trakt med et 47 millimeter (diam) membranfilter som blir satt under vakuum.   Bakterier i prøven blir oppkonsentrert på overflaten av filteret. I et sterilkabinett tas filteret ut med en steril pinsett og plasseres på overflaten av en næringsagar i en petriskål. Næringsstoffer fra agaren passerer filteret slik at bakteriene kan vokse på overflaten av filteret. Med forskjellig typer diameter på porene i membranfilteret kan man isolere forskjellige typer bakterier, sopp og gjær, 0.2 µm, 0.45 µm og 0.8 µm membranfilter.

Antibiotikaresistens

Hvis man ønsker å se om det er antibiotikaresistente bakterier i prøven plates en prøve med stort bakterieantall ut på en agarplate hvor det er lagt ut små runde disker med forskjellige typer antibiotika som vil diffundere ut i agarplaten. Antibiotikaresistente bakterier vil vokse helt inntil de runde diskene, mens bakterier som ikke tåler et antibiotika lager en klar sone rundt disken.

Agar og vekstmedium

I identifisering av hvilke bakterier som vokser opp benyttes forskjellige typer agarmedier, hvor bakteriekolonier også kan bli overført til et annet kulturmedium for nærmere identifisering.

Næringsagar er en generell agar med 0.5%pepton, 0.3% biffekstrakt-gjærekstrakt, 0.5% NaCl, 1.5% agar i destillert vann, pH 6.8 ved 25oC. Natriumklorid tilsettes som osmotikum tilsvarende det man kan forvente å finne i celler. Etter autoklavering ved 120oC i en autoklav eller trykk-koker i minst 20 minutter, lenger tid for større volumer, avkjøles agaren og helles i petriskåler. Et alternativ er bruk av mikrobølgeovn for å smelte agaren. Petriskålen oppbevares kaldt opp-ned inntil de skal brukes. Dette er et generelt vekstmedium til bl.a. undervisningsøyemed

Blodagar innholder 5-10% blod fra pattedyr (sau eller hest). Blodagar blir brukt for å anrike hemolyttiske bakterier fra slektene Streptococcus og Staphylococcus som lyserer de røde blodlegemene.

Sjokoladegar inneholder ikke sjokolade, men er en blodagar hvor blodcellene er lysert ved oppvarming til ca. 56oC. Vekstmediet må inneholde en karbon- og nitrogenkilde, vitaminer, og  mineraler. Hvordan disse blir tilført er avhengig av type vekstmedium.

Trypton (pepton) kan tilsettes agaren som aminosyrekilde.Trypton blir laget fra melkeprotein (kasein) som er enzymatisk nedbrutt av proteasen trypsin og fungerer som nitrogenkilde i form av oligopeptider, peptider og aminosyrer. Kasamino blir laget fra sur hydrolyse av kasein og inneholder bare aminosyrer.

Kjøttektrakt og gjærekstrakt er andre stoffer som kan tilsettes i mediet.

 2% agar gir en hard overflate på agarskålen, og en mindre agarprosent gir en mykere agar (softagar). Karbonkilden kan være med å identifisere bakterietypen i en koloni, for eksempel hvis laktose er den eneste C-kilden i mediet. Gram-farging blir benyttet for å klassifisere bakteriene i gram-positive og gram-negative bakterier, og ved tilførsel av gallesalter og krystallfiolett i agaren hemmes vekst av Gram-positive bakterier (G+). Collistin (polymyxin E) er et syklisk peptid antibiotikum laget av bakterien Paenibacillus polymyxa, og som hemmer veksten av gram-negative bakterier, og kan tilsettes i vekstmediet hvis man vil fremme veksten av gram-positive bakterier. 

TSA-agar (tryptikase soy agar) inneholder enzymatisk nedbrutt kasein og  soyabønnemel og er en generell agar, som også kan tilsettes blodekstrakt.

Mac Conkay agar er en laktose-agar som inneholder gallesalter, krystallfiolett og nøytralrødt og blir brukt til å skille G+ og G- - bakterier

EMB-agar (Levines agar) blir brukt for å identifisere Gram-negative (G-) bakterier. EMB-agar inneholder fargestoffene eosin Y: metylenblått (6:1), laktose, pepton og agar. Bakterier som kan fermentere laktose slik som E.coli lager syre, mens de som ikke kan fermentere laktose slik som Shigella og Salmonella gir økt pH i mediet ved deaminiering av proteiner. En agar med laktose og nøytralrødt blir brukt for å skille laktose-fermenterer fra de som ikke kan utnytte laktose.

Galle-esculin-agar er et vekstmedium som inneholder gallesalter og esculin, og blir brukt til å skille bakterieslektene Enterococcus fra Streptococcus. Enterococcus er fakultativt anaerobe melkesyrebakterier som ofte lever som kommensaler i tarmen hos pattedyr. Enterococcus kan bryte ned esculin, og hydrolyseproduktene fra esculin reagerer med Fe(III)-citrat i mediet og gir mørkefargete jernutfellinger.

CLED-agar (cystin laktose elektrolyttmanglende agar) er en laktose-agar som inneholder fargestoffet bromtymolblått (BTB). Laktose-positive kolonier lager syre som gjør at BTB får gul farge, mens bakterier som kan dekarboksylere aminosyren cystin gir kolonier med blå farge, slik at man kan skille laktose-positive og laktose-negative bakterier.

Bakterien Streptococcus agalactiae er en G+ og β-hemolyttisk, katalase-negativ bakterie, i gruppe B Streptococcus som man kan identifisere på basis av det røde pigmentet granadaen som bakterien produserer,  et ikke-isoprenoid polyen med 12 karbon-karbon dobbeltbindinger.

MSA-agar er en mannitol saltagar for organismer som kan fermentere sukkeralkoholet manitol til melkesyre. Agaren har høyt innhold av salt, 7-10% NaCl som Staphylococcus aureus kan tåle, og fenolrødt i agaren blir gul hvis mannitol blir fermentert.

XLD-agar (xylose-lysin-deoksycholat) blir brukt til å selektere Salmonella og Shigella. Salmonella kan fermentere sukkeralkoholdet xylose og lager et surt nedbrytningsprodukt som gir gul farge på pH-indikatoren fenolrødt. Shigella kan ikke vokse på xylose. Salmonella kan også dekarboksylere aminosyren lysin, pH stiger og koloniene blir rødfarget som for Shigella, men i tillegg kan Salmonella omdanne tiosulfat til hydrogensulfid som gir et mørkt sentrum i kolonien. Agaren inneholder bl.a. xylose, L-lysin, sukrose, laktose, fenolrødt, NaCl (0.5%), og natriumtiosulfat

LB-medium er en lysogen agar som opprinnelig ble brukt til å identifisere bakteriefagene P1, P2 og P3 i E.coli som gir plakk på agaren når bakterie blir lysert av bakteriofagene. Bakterien Shigella gir også plakk. LB-medium blir mye brukt til å dyrke rekombinant E.coli.

Thayer-Martin agar er en sjokolade-blodagar for selektering av Neisseria. Agaren inneholder VCN-antibiotika, vancomycin som hemmer vekst av Gram-postitve bakterier, colistin som hemmer  vekst av Gram-negative , nystatin som hindrer soppvekst, sammt trimeoprim som hemmer vekst av den Gram-negative  nosokomiale saprofyttbakterien Proteus.

Maltagar, potetagar og Sabouraud-agar med dekstrose og pepton er eksempler på agar som benyttes til dyrking av sopp.

Elektronisk telling (Coulter-counter)

Bakterier kan også telles i en coulter-counter hvor prøven med bakterier passerer mellom to elektroder. Den ene elektroden er i et glassrør med en kapillar pore som bakteriene må passere. Denne metoden skiller ikke levende fra døde bakterier, men kan gi en størrelsesfordeling av bakteriecellene.

Indirekte telling turbiditet

Optisk tetthet i en bakteriesuspensjon er proporsjonal med antall celler, og kan måles i et spektrofotometer. Bakteriene sprer lyset. og jo flere bakterier desto mer av lyset blir spredd og kommer ikke fram til fotomultiplikatoren og blir registrert. Lysspredning er det samme fenoment som gir blåfarget himmel, og at kolloider i et melkeglass sprer lyset slik at det ser blålig ut. Blått lys spres mer enn rødt, jfr. solnedgang.

Poissonfordeling og telling

Man bør i utgangspunktet ha replikater med  flere petriskåler for hver prøve.

Antall bakteriekoloner i et tellekammer eller antall kolonier på en agarplate er telling av hendelser som skjer tilfeldig i tid og rom og kan beskrives av Poisson-fordelingen.

Poissonfordelingen er en diskret sannsynlighetsfordelingen bare bestemt av gjennomsnittsverdien E(X) = µ, og variansen er lik telletallet Var(X) = σ2 = µ

\(P\left(X=k\right)=\frac {e^{-\mu}\mu^k} {k!}\)

hvor k = {0, 1, 2, 3, …n}

Hvis µ er større enn 5 har fordelingen form som en normalfordeling. For eksempel hvis vi har en Poissonvariabel med forventet verdi  µ = 10 kolonier per plate, så blir sannsynligheten for å få  k=14 bakteriekolonier ca. 5.2%

Publisert 24. feb. 2017 12:45 - Sist endret 24. feb. 2017 12:45