Ikke-protein delen av et protein, men som er nødvendig for optimal aktivitet eller funksjonalitet av et protein kalles en kofaktor. Er kofaktoren et organisk molekyl kalles den et koenzym. Proteindelen av et enzym uten kofaktor kalles apoenzym. Holoenzym = apoenzym + kofaktor. Kofaktor er en generell betegnelse på stoffer som aktiverer enzymer, og omfatter koenzymer, prostetiske grupper og uorganiske metallaktivatorer. Koenzymer kan være prostetiske grupper eller alternativt kosubstrater.
Prostetiske grupper er vanligvis fast bundet til enzymet, blant annet i kovalent binding. Hem er et eksempel på en prostetisk gruppe og er bundet til proteinet f.eks. til enzymet peroksidase eller i cytokromer. Mange enzymer trenger monovalente og/eller divalente kationer for å ha optimal aktivitet f.eks. zink (Zn2+ i karbonsyre anhydrase, DNA polymerase, alkohol dehdrogenase), mangan (Mn2+ i arginase), kobber (Cu2+ i cytokrom oksidase, polyfenoloksidase) , jern (Fe2+ i katalase, cytokrom, nitrogenase, hydrogenase, jern-svovelklynger Fe2S2), molybden (Mo4+ i nitrat reduktase nitrogenase). Enzymer som har ATP som substrat trenger også magnesium (Mg2+), siden det er MgATP som er substratet for enzymet. Mange enzymer i planter trenger opptil 100 mM kalium (K+) for optimal aktivitet. Urease fra planter trenger nikkel (Ni2+). Glutation peroksidase fra mennesker trenger selen. Fosforylering via protein kinase og defosforylering via defosforylase er viktig prosesser i aktivering av enzymer. Det samme gjelder oksidasjon av disulfidbindinger hvor bl.a. thioredoksin deltar. Noen enzymer finnes som proenzymer og blir ikke enzymatisk aktive før en del av proteinet blir enzymatisk fjernet.
Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD(P)+), FMN, pyridoksalfosfat, askorbat, thiamindifosfat, biotin, tetrahydrofolinsyre og koenzymA (CoA) er eksempler på koenzymer. Et koenzym er en del av det aktive setet på enzymet. Mange vitaminer er deler av koenzymer. For eksempel følgende B-vitaminer: niacin (vitamin B3) i NAD(P)+ som deltar i oksidasjon eller overføring av hydrogen, f.eks. mellom alkoholer, aldehyder og ketoner. Riboflavin (vitamin B2) er en del av flavin mononukleotid (FMN) eller flavin adenin dinukleotid (FAD)og deltar i redoks-reaksjoner . Pyridoksin, pyridoksal og pyridoksamin (vitamin B6) er en del av koenzymet pyridoksalfosfat og deltar b.a. i transaminering og dekarboksylering. Pantothensyre er en del av koenzym A og deltar i overføring av acetylgrupper. Thiamin (vitamin B1) er en del av thiaminpyrofosfat og deltar i overføring av aldehyd. Vitamin B12 er en del av koenzym B12 . Biotin (vitamin H) er en del av det som kalles B-vitaminkomplekset.