Budbringer-RNA (mRNA) inneholder en genetisk kode som oppskrift på et spesifikt protein fra patogenet som gir sykdom. mRNA er ustabilt, blir lett nedbrutt og for å beskytte det og få det inne i cellene blir det pakket inn i små fettblærer (vesikler). Deretter injisert i en muskel hvor fettvesiklene med mRNA blir tatt opp av cellene via samme system som for eksosomer. mRNA-stabilitet og levetid for mRNA i celller blir anvendt for å lage riktige mengder protein og til rett tid.
For de første typene mRNA-vaksine fra Pfizer og Moderna mot covid-19 bruker man mRNA fra viruset som koder for S-protein som danner piggene («Spike») utenpå coronaviruset. Det blir også arbeidet med å utvikle mRNA-vaksiner i behandling av kreft og allergi, og som vaksine mot andre virus som influensa-, parainfluensa-, metapneumo-, herpes-, respiratorisk syncytial-, zika- og cytomegalo-virus.
Etter å ha bli injisert i muskelceller og frigitt fra nanolipidpartiklene som virker mRNA som en oppskrift (templat) for proteinsyntese og lager spikeprotein på grynet endoplasmatisk retikulum med ribosomer. Nysyntetisert spikeprotein blir deretter fraktet med Golgivesikler til overflaten av plamamembranen på celler hvor de blir gjenkjent av B celler bundet til B-cellereseptorer som deretter lager spikespesifikke antistoffer.
En mRNA-vaksinen lager fremmedproteiner på stedet (in situ) i kroppscellene som resulterer i en væskebasert (humoral) og cellebasert immunrespons med hukommelse i immunsystemet. Fremmedproteinet virker som et antigen og har en overflate, epitope, som aktiverer immunsystemet til å lage antistoffer mot fremmedproteinet. Det proteinet som mRNA i vaksinen koder for er vanligvis et overflateprotein fra patogenet, og som patogenet anvender for å komme inn i cellene.
Neste gang immunsystemet kommer i kontakt med en bakterie eller virus som inneholder et protein mRNA kodet for så starter kroppens immunsystem et motangrep med å produsere antistoffer mot fremmedproteinet, naturlige dreperceller og makrofager som fjerner infiserte celler.. Siden man bruker RNA vil det ikke påvirke genmaterialet (genomet) til den som blir vaksinert. Forskjellig fra en DNA-vaksine hvor det finnes en mulighet for at DNA kan bli inkorporert i kjernegenomet til den vaksinerte. mRNA er en midlertidig bærer av informasjon og gir et fleksibelt verktøy i produksjon av vaksiner, og er en velegnet vektor for overføring av immunrespons. mRNA kan ikke formere seg selv og blir nedbrutt i løpet av kort tid i cellene. En ulempen mRNA-vaksine er at det må bli lagret ved lav temperatur fordi mRNA blir så lett nedbrutt. Det er forskjellige hovedtyper vaksiner:
1.Genbasert triplettkoder (kodoner) i mRNA for et overflateprotein i mRNA-vaksine og bruk av ribosomene i cytoplasma eller koblet til endoplastmatisk retikulum til å lage proteinet.
2. Vektorbasert vaksine som bruker et immobilisert (inaktivert vert) virus, for eksempel etadenovirus, som vektor som bringer med seg koden for å lage protein,
3. Proteinbasert vaksine med forsvaket eller rekombinant protein.
4. Genbasert vaksine med DNA-kode, DNA-vaksine, men denne må først inn i cellekjernen for å bli transkribert til budringer-RNA (mRNA) som deretter oversettes til protein. Ulempen med en DNA-kode er at den kan bli inkorporert i organismens DNA.
Proteinsyntese hos eukaryoter som mRNA-vaksinen benytter
Proteiner i en organisme blir laget fra en DNA-kode:
DNA → mRNA → protein
En bit av DNA fra en promotersekvens til en termineringssekvens utgjør et gen som kan transkriberes til mRNA. RNA består av de fire nukleotidbasene Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) og Uracil (U). Deler av DNA som koder for protein kalles eksoner og ikke-kodende deler kalles introner. mRNA som inneholder både eksoner og introner kalles pre-mRNA. Før mRNA kan transporteres ut av cellekjernen må pre-mRNA gjennom en posttranskripsjonsprosess som lager funksjonelt og virksomt mRNA. Prosessering sker i et spleisosom hvor ikke-kodende introner blir fjernet og de gjenværende eksoner koder for et protein. En 5’ og 3’ ikketranslatert region (UTR) i hver ende av den kodende sekvensen regulerer translasjon og stabiliteten til transkriptet Dessuten skjer det endringer i hver ende av mRNA-molekylet. Det settes på en 5’-cap med 7-metylguanosin i den fremre enden av mRNA festet til første nukleotidet ved 5’-5’ lenking. Hydroksylgruppen 2’OH på ribose på første nukleotid blir metylert. Strukturen på 5’-cap bestemmer forskjellen på selv og ikke-selv mRNA og deltar i binding av mRNA til ribosomer. Flere adeninmolekyler (A) blir hektet på og danner en poly-A hale i den andre enden av mRNA. Poly-A halen reduserer nedbrytningen via eksonuklease, tiltrekker seg poly-A-bindende proteiner. Det er også en utranslaterbar region (UTR) i hver sin ende av mRNA, 5’UTR og 3’UTR.
mRNA molekyl med genetisk kode klar til oversettelse til protein
7-metylguanosin – ekson1-ekson2-ekson3-ekson4-ekson5-AAAAAAAA
Det kan også skje en alternativ spleising hvor det lages forskjellige kombinasjoner av eksoner som kan gi flere forskjellige genprodukter fra samme gen. Alternativ spleising er vanlig hos mennesker, I den ferdige formen kan mRNA fraktes ut gjennom kjerneporekomplekset og ut i cytoplasma. Hastighet på translasjonen til protein og varighet avhenger av type mRNA og mRNA-stabilitet, en halveringstid bestemt ut fra fysiologisk rolle. Gener som koder for proteiner i den generelle husholdningen i cellene har lenger levetid enn dem som deltar i kortvarige prosesser for eksempel trinn i celledeling og differensiering. Gjennomsnitt levetid for et mRNA en celle er ca. 7 timer. Faktorer som påvirker levetid og translasjon er AU-rike elementer i (ARE) med mye adenin og uridin baser i 3’-ikketranslaterbar region (3’-UTR), histon stamme-løkker, jun kinase respons elementer, små interfererende RNA (siRNA), mikro RNA (miRNA), og piwi-interagerende RNA (piRNA). Budbringer RNA (mRNA) koder informasjon i form av basesekvens men også i sekundærstrukturen til ikke-translaterbare skevenser (UTR).
Et eksempel på mRNA med lang levetid er mRNA for globin i hemoglobin i utviklingen av røde blodceller (erytrocytter). Erytroblaster med opprinnelse fra stamceller beinmargen gjennomgår modningsstadier hvor cellekjernen forsvinner og danner retikulocytter. Disse gir til slutt bikonkave røde blodceller som fylles med hemoglobin selv om cellekjernen er forsvunnet.
Ribosomer i cytoplasma har bindingssete som binder mRNA. Proteinsyntesen med mRNA som oppskrift (templat) har tre faser: start (initiering), elongering (forlengelse) og terminering (stopp). Hver fase er regulert av flere proteinfaktorer. Når mRNA bindes til et polyribosom i et preinitieringskompleks deltar flere enn ti forskjellige eukaryote transkripsjonsinitieringsfaktorer
Første kodonet som avleses fra mRNA, startkodonet AUG koder for aminosyren metionin. Kodon på mRNA gjenkjennes av antikodon på spesifikke transport-RNA (tRNA) og bringer aktivert. Ribosomet har i tillegg to andre bindingsseter hvorav ett binder tRNA festet til en aminosyre, som start tRNAmet. Deretter forflyttes mRNA og ribosom en triplett (tre nukleotider) i forhold til hverandre og koden for neste aminosyre blir avlest. Et enzym på ribosomet katalyserer en peptidbinding mellom to aminosyrer. Deretter flyttes mRNA til neste kodon og neste aminosyre i proteinet blir hektet og bundet med peptidbinding. Slik fortsetter peptidet å øke i lengdet inntil stoppkodonet UAA stopper translasjonen, og mRNA og det nylagete proteinet frigis fra ribosomet.
Flere ribosomer kan binde seg til et mRNA, et polyribosom slik at det blir laget flere proteiner samtidig. Transkripsjon til mRNA er nøye regulert i cellene. Alle somatiske celler inneholder samme DNA, men bare de nødvendige genene blir transkribert. Alle mRNA i en celle danner et transkriptom.
Enktelttrådete positiv sens RNA virus slik som SARS-Cov-2 har et genom som virker direkte som et mRNA og får de infiserte cellene til å lage proteiner som inngår i nye viruspartikler. Mønstergjenkjenningsreseptorer blir aktivert av mRNA i et patogenassosiert molekylært mønster (PAMP). Enkelttrådet og dobbelttrådet RNA aktiverer Toll-lignende reseptorer som en del av immunssystemet og gir betennelsesreaksjoner.
mRNA-vaksine
På begynnelsen av 1990-tallet forsøkt man å lage vaksine med anti-sens RNA, små interfererende RNA (siRNA), eller transfeksjon av RNA. Man trodde at mRNA var for ustabilt til at det kunne egne seg som en vaksine, selv om idéen om dette allerede var introdusert på begynnelsen av 2000-tallet. mRNA blir raskt nedbrutt av det allestedsnærværende enzymet ribonuklease (RNase) og må beskyttes mot nedbrytning. Generelt er mRNA stabilitet i cellene under streng reguleringskontroll. Immunsystemet kan også ødelegge det som organismen oppfatter som fremmede nukleinsyrer.
For at mRNA fra vaksinen skal komme inn i cellenes cytoplasma må det passere flere barriærer. Fettdråpene vaksinen er pakket inn i blir tatt opp av cellene som har et eget opptakssystem for vesikler. Inne i cytoplasma blir mRNA med kode for fremmedprotein bundet til ribosomer og oversatt til protein.
Om SARS-Cov2
SARS-Cov-2 (alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus) er et positiv sens enkelttrådet RNA-virus (+)ssRNA) som gir coronavirusssykdom 2019 (COVID-19). Genomstørrelse er ca. 30 kilobaser (kb), med kode for 14 åpne leseramme. Åpen leseramme ofr1ab koder for et polyproteinet bestående av overflateglykoproteinet S, kappeproteinet E, membranproteinet M og nukleokapsidproteinet N. Disse proteinene som viruset trenger for å lage nye viruspartikler blir laget i en sammenhengende proteinstreng som blir kappet i sine respektive biter av en protease. En type antivirale terapier anvender protetaseinhibitorer som hemmer denne proteasen. Overflateglykoproteinet spike (S) blir kodet av 3822 baser S-gen. S-proteinet binder seg til angiotensin-konverterende enzym 2(ACE2) som overflatereseptor som viruset bruker for å komme inn i cellene. ACE2 er overflateprotein på epitelceller i lungene, og overflateceller i hjerte, nyrer, urinblære og krumtarmen (ileum). RNA-virus endrer genomet sitt mye raskere enn DNA-virus. Selv om SARS-Cov 2 har noe korrekturlesing via nsp14 (eksonuklease N)-nsp10-kompleks så lager RNA-replikase mange feil i kopieringen som raskt gir mange nye virusvarianter.
Hvordan lage mRNA
Karikó oppdaget mRNA med pseudouridin som modifisert basse ble mer effektivt translatert. RNase og endonuklease kan ødelegge mRNA. For å øke stabiliteten og levetiden til mRNA i vaksinen er det satt inn modifiserte nukleosidbaser (N-metyl-pseudouridin, 5-metoksyuridin, eller metylpseudouridin) i stedet for uracil, og nukleosidmodifisering via metylering. Andre slike modifiserte baser i tillegg til pseudouridin (Y) er 5-metylcytidin (m5C), N6-metyladenosin (m6A), 5-metyluridin (m5U) og 2-thiouridin (s2U) . Dette øker translasjonen og reduserer nedbrytning. 2’-O-metylribose eller 2-flurororibose kan settes inn i stedet for vanlig ribose. Det gjøres en optimalisering av 5’ og 3’ –ikke transladert region (UTR) og lengden på poly A, samt kodonoptimalisering, For å øke stabiliteten til fosfodiesterbindingen brukes fosforotiolat med svovel , peptid-amid eller fosforoamid.Nukleinsyrer er store molekyler og negativt ladet grunnet sukkerfosfatbindingen. De pakkes derfor i kationlipider.
Katalin Karikó og Drew Weissman fikk nobelprisen i fysiologi eller medisin 2023 « for deres oppdagelser vedrørende modifisering nukleosidbaser som gjorde det mulig å utvikle effektive mRNA-vaksiner mot COVID-19».. Den ungarsk-amerikanske biokjemikeren Katalin Karikó (f.1955). møtte i 1997 immunologen Drew Weissman (f. 1959) ved Universitetet i Pennsylvania hvor de utvekslet idéer og startet samarbeid. Den første bruken av terapeutisk bruk av mRNA ga betennelsesreaksjoner og alvorlige bivirkninger, men etter iherdig arbeid med bruk av syntetiske nukleosider som bremset nedbrytningen av mRNA, samt pakking av mRNA i lipid nanovesikler grunnlaget for selskapene BioNTech og Moderna medmRNA COVID-19-vaksine.
Litteratur
Andresen JL & Owen S Fenton OS: Nucleic acid delivery and nanoparticle design for COVID vaccines. MRS Bull. 14 (2021)1-8,doi: 10.1557/s43577-021-00169-2.
Midoux P & Pichon C: Lipid-based mRNA vaccine delivery systems. Expert Rev Vaccines 14(2) (2015) 221-234.doi: 10.1586/14760584.2015.986104.
Kariko K et al :Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther, 16(11) (2008) 1833-40.
Mauger DM, Cabral BJ, Presnyak V, Su SV, Reid DW, Goodman B, Link K, Khatwani N, Reynders J, Moore MJ, McFadyen IJ: mRNA structure regulates protein expression through changes in functional half-life. Proceedings of the National Academy of Sciences 116 (48) (2019)24075-24083, DOI: 10.1073/pnas.1908052116
Park JW, Lagniton PNP, Liu Y, Xu RH: mRNA vaccines for COVID-19: what, why and how. Int J Biol Sci. 2021;17(6) (2021)1446-1460, doi:10.7150/ijbs.59233
Pascolo S: Messenger RNA-based vaccines. Expert Opin Biol Ther. 4(8) (2004):1285-1294.doi: 10.1517/14712598.4.8.1285.
Schlake T, Thess A, Fotin-Mleczek M & Kallen K-J: Developing mRNA-vaccine technologies. RNA Biology 9:11 (2012) 1319–1330.
Pascolo S: The messenger's great message for vaccination. Expert Rev Vaccines 14(2) (2015)153-156. doi: 10.1586/14760584.2015.1000871
Wikipedia